海南新收集煙草種質(zhì)資源的鑒定與遺傳多樣性分析

向小華，李 媛，張興偉，劉國(guó)祥，楊 菁，趙文濤，聞 剛，邵 雨，范靜苑，呂洪坤

（1中國(guó)煙草總公司海南省公司海口雪茄研究所，海口571100；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島266101；3上海新型煙草制品研究院有限公司，上海201315；4海南省煙草公司儋州公司，海南儋州571700；5四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司長(zhǎng)城雪茄煙廠，四川什邡618400）

0 引言

種質(zhì)資源遺傳多樣性研究有利于對(duì)作物進(jìn)行可持續(xù)的開發(fā)利用，廣泛考察收集是豐富種質(zhì)資源遺傳多樣性最有效的方法之一[1]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部啟動(dòng)《第三次全國(guó)農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動(dòng)》以來(lái)，煙草種質(zhì)資源考察收集工作在各地區(qū)有序開展[2-4]。截至2019年底，國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)保存的資源數(shù)量達(dá)6057份，位居世界之首。

為在育種中更準(zhǔn)確地利用收集到的煙草新種質(zhì)，應(yīng)將種質(zhì)資源多樣性和遺傳背景分析作為基礎(chǔ)性研究，其主要方法有農(nóng)藝性狀調(diào)查、化學(xué)成分分析、評(píng)吸鑒定和分子標(biāo)記。其中，表型性狀鑒定是種質(zhì)資源遺傳多樣性研究最基本的方法。方敦煌等[5]采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)231份烤煙種質(zhì)的13個(gè)主要化學(xué)成分和農(nóng)藝性狀進(jìn)行了遺傳多樣性分析。屈旭等[2]對(duì)湖南收集到的23份特色種質(zhì)的22個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行了鑒定和遺傳多樣性分析。鞠馥竹等[6]對(duì)5個(gè)產(chǎn)區(qū)98份晾曬煙資源進(jìn)行了農(nóng)藝性狀調(diào)查、化學(xué)成分測(cè)定以及遺傳多樣性分析，并從中篩選出綜合評(píng)價(jià)優(yōu)異的8份資源。但表型性狀易受環(huán)境等外在因素的影響，因此應(yīng)結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)更加準(zhǔn)確地研究物種的遺傳規(guī)律。SSR標(biāo)記憑借其操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)在煙草以及其他作物的遺傳多樣性研究中被廣泛應(yīng)用[7-11]。軒貝貝等[12]篩選出8對(duì)SSR引物，將9個(gè)烤煙品種進(jìn)行有效區(qū)分；陳芳等[13]利用48個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)80份煙草材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，從中篩選出4對(duì)核心引物構(gòu)建了數(shù)字指紋圖譜。在曬煙研究方面，李輝等[14]利用25對(duì)SSR引物對(duì)67份地方曬煙品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析；劉國(guó)祥等[3]利用25對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)33份曬煙材料進(jìn)行了分析，并從中選取6個(gè)標(biāo)記構(gòu)建了計(jì)算機(jī)化的指紋圖譜。

本研究對(duì)在海南收集到的23份煙草種質(zhì)資源進(jìn)行田間表型鑒定，并利用12對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析，繪制SSR指紋圖譜，以期為海南曬煙資源的高效利用、重要基因挖掘、品種選育和新品種審定等工作提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

根據(jù)《第三次全國(guó)農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動(dòng)》的要求，中國(guó)煙草總公司海南省公司海口雪茄研究所按照《種質(zhì)資源普查與收集行動(dòng)》技術(shù)規(guī)范中的系統(tǒng)調(diào)查流程在海南省內(nèi)進(jìn)行了多輪考察收集，共收集到23份煙草新種質(zhì)，多為典型地方曬煙資源。種質(zhì)資源的編號(hào)、來(lái)源及種質(zhì)名稱見表1。

表1 供試的煙草種質(zhì)資源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間性狀調(diào)查 供試材料于2018—2019年連續(xù)2年種植在海南省儋州市試驗(yàn)基地，田間管理按當(dāng)?shù)亟y(tǒng)一模式進(jìn)行，田間性狀記載按照《煙草種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[15]，每份材料選取5株進(jìn)行性狀調(diào)查，其中數(shù)量性狀以2年的平均數(shù)作為最終結(jié)果。

1.2.2 基因組DNA的提取 將采集到的煙草幼嫩葉片用SLS法提取基因組DNA。將DNA濃度統(tǒng)一稀釋到50 ng/μL，在-20℃低溫下長(zhǎng)期保存。

1.2.3 SSR引物與PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增總體10μL，其中包括2×Taq PCR Mastermix 5μL、模板DNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、雙蒸水2μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min后，94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min停止反應(yīng)，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Excel計(jì)算農(nóng)藝性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。采用張倩男等[16]的方法計(jì)算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H')。聚類分析過(guò)程中將質(zhì)量性狀按照《煙草種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[15]進(jìn)行賦值，種質(zhì)間遺傳距離為歐氏距離，聚類方法采用UPGMA。選擇帶型清晰的PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)行人工讀帶，有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，建立“0/1”矩陣，使用Data Formater軟件進(jìn)行矩陣的轉(zhuǎn)換。用Popgene 32軟件計(jì)算觀察等位基因數(shù)Na(observed number of alleles)、有效等位基因Ne(effective number of alleles)、Nei’s基因多樣性指數(shù)H(Nei's gene diversity)、Shannon’s多態(tài)信息指數(shù)I(Shannon’s information index)以及品種間成對(duì) Nei’s遺傳距離(Nei’s genetic distance)。使用統(tǒng)計(jì)軟件NTSYS-PCver 2.1分析23個(gè)供試煙草品種間遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA進(jìn)行聚類分析，繪制聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種質(zhì)資源形態(tài)特征

各種質(zhì)資源株型有塔形和筒形2種；葉形有長(zhǎng)卵圓、長(zhǎng)橢圓、寬橢圓、橢圓、卵圓共5種；葉尖以漸尖為主；葉面形態(tài)特征以較平為主；葉緣以波浪和微波為主；葉耳有小、中、大和無(wú)葉耳4種；除HN7葉色為深綠外，其余葉色均為綠或黃綠色；葉片主脈除HN17為粗外，其余均為中或細(xì)；葉片厚度多為中等；花序密度多為密集，少數(shù)為松散；花序形狀多為菱形；花色以淡紅為主（表2）。遺傳多樣性分析結(jié)果表明，葉形的多樣性指數(shù)最高，為2.111；其次是葉耳和葉面，多樣性指數(shù)分別為1.914和1.721，花色的多樣性指數(shù)最低，僅為0.808。

表2 各煙草種質(zhì)主要形態(tài)特性

續(xù)表2

2.2 農(nóng)藝性狀分析

在田間調(diào)查了株高、莖圍、節(jié)距、葉數(shù)和葉長(zhǎng)寬等，并計(jì)算其變異系數(shù)（表3）。23份材料的平均株高為144.00 cm，最高的是HN22(231.00 cm)，HN5株高最矮(70.00 cm)；莖圍4.4～9.8 cm，平均莖圍6.8 cm；HN6和HN20節(jié)距最大，均大于10 cm；葉數(shù)大于25的有HN1、HN7和HN8；葉片最長(zhǎng)的是HN2(69.40 cm)，葉寬最長(zhǎng)的是HN7(32.60 cm)，HN3的葉片長(zhǎng)和寬均最小，分別為27.00、15.60 cm；葉片主側(cè)脈夾角均為中度，莖葉角度大多為大度，少數(shù)為中度。所調(diào)查的農(nóng)藝性狀變異系數(shù)范圍為20.69%～29.41%，其中葉數(shù)的變異系數(shù)最大，莖圍的變異系數(shù)最小。

表3 主要農(nóng)藝性狀

2.3 基于田間表型性狀的聚類分析

使用SPSS 22.0軟件對(duì)新收集煙草種質(zhì)資源的21個(gè)田間表型性狀進(jìn)行聚類分析，以歐氏距離為遺傳距離，聚類方法采用類平均法(UPGMA)在，遺傳距離15處將這些種質(zhì)分為3個(gè)類群（圖1）。

圖1 煙草種質(zhì)基于田間表型性狀的聚類圖

第Ⅰ類群包括14份種質(zhì)，株型以塔形為主，葉形豐富，葉面多為較平，葉緣微波和波浪為主，葉色為綠或黃綠，花序密度以松散為主；株高多在140.00 cm左右，平均葉數(shù)為16.67，葉片較大，大多無(wú)葉柄。第Ⅱ類群包括5份種質(zhì)，株形以筒形為主，葉形以長(zhǎng)卵圓為主，葉緣微波或皺折，葉片主脈粗細(xì)為中，花序密度以松散為主；株高較高，平均為186.24 cm，莖圍和節(jié)距均較大，葉數(shù)也最多，平均21.92片，葉片最大，平均葉長(zhǎng)52.92 cm、葉寬26.08 cm。第Ⅲ類群包括3份種質(zhì)，株型為筒形，葉形卵圓或?qū)挋E圓，葉尖漸尖，葉緣較平，葉緣波浪，葉色綠，葉片主脈粗細(xì)為細(xì)，葉片厚薄中等，淡紅色花；株高矮小，平均73.66 cm，莖圍較小，節(jié)距較短，葉數(shù)較少，平均13.66片，葉片較小，平均葉長(zhǎng)31.29 cm、葉寬17.13 cm。

2.4 SSR引物的篩選

利用6份煙草種質(zhì)[‘Little Dutch’、‘H211’、‘Beinhart 1000-1’、‘Hicks’(Broad Leaf)、‘Havana 10’、‘H382’]篩選2000對(duì)Bindler公布的SSR標(biāo)記，選取出多態(tài)性好、條帶穩(wěn)定清晰的12對(duì)引物，其序列見表4。

表4 SSR引物序列

續(xù)表4

2.5 SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析

數(shù)據(jù)分析結(jié)果（表5）顯示，觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)在2～7之間，平均值為3.8333，位點(diǎn)PT51398和PT53568等位基因數(shù)最多（7個(gè)）。有效等位基因數(shù)(Ne)1.1050～5.1882，平均值為2.3357，位點(diǎn)PT53568有效等位基因數(shù)最多，位點(diǎn)PT50668有效等位基因最少，有效等位基因所占比例為60.93%。觀測(cè)雜合度(Ho)變化范圍為0.1731～0.9026，平均值為 0.5301。期望雜合度(He)變化范圍為0.0974～0.8269，平均值為0.4700。平均Nei’s多樣性指數(shù)(H)為0.4593。Shannon信息指數(shù)(I)在0.1985～1.6164之間，平均值為0.8930。不同位點(diǎn)之間遺傳參數(shù)存在差別，He平均值小于0.5，說(shuō)明供試材料遺傳多樣性不高。

表5 12對(duì)SSR標(biāo)記在23份材料中的多態(tài)性信息

2.6 基于SSR標(biāo)記遺傳多樣性的聚類分析

利用12對(duì)SSR引物對(duì)23個(gè)供試煙草資源擴(kuò)增出46個(gè)等位基因，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出3.83個(gè)。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制0/1二維矩陣，使用NTSYS計(jì)算23個(gè)供試曬煙資源之間的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離指數(shù)。結(jié)果表明，各曬煙資源間的遺傳相似性系數(shù)為0.143～1.000。在相似性系數(shù)0.206處可將供試曬煙資源分為2個(gè)類群（圖2）。其中HN2（海南島-2）和HN8（海南6）單獨(dú)聚為一類，與其他供試材料遺傳距離最遠(yuǎn)，且均來(lái)自于海南省陵水縣。HN1和HN21，HN3和HN4，HN5、HN12和HN15遺傳距離最近。從聚類圖中還發(fā)現(xiàn)，聚類結(jié)果與資源的地理來(lái)源沒有明顯的相關(guān)性。

圖2 基于23份煙草種質(zhì)資源12對(duì)SSR標(biāo)記的聚類圖

2.7 23份煙草種質(zhì)資源指紋圖譜的構(gòu)建

根據(jù)12對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果（以引物PT50599為例，圖3），結(jié)合參照分子量標(biāo)記，構(gòu)建23個(gè)供試煙草資源的指紋圖譜（圖4）。在后期進(jìn)行資源鑒定和品種審定時(shí)，可利用這12對(duì)SSR標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果獲得其指紋圖譜，與已有的指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，即可完成鑒定。

圖3 引物PT50599對(duì)23份煙草種質(zhì)資源PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 23份煙草種質(zhì)資源的指紋圖譜

3 結(jié)論與討論

本研究采用21個(gè)田間表型性狀對(duì)煙草種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，23份煙草資源遺傳多樣性總體較高，農(nóng)藝性狀變異系數(shù)范圍為20.69%～29.41%，質(zhì)量性狀的遺傳多樣性指數(shù)范圍為0.808～2.111。利用表型性狀可將這23份資源進(jìn)行分類，其中第Ⅱ類群的植株較高、葉片較大、葉數(shù)較多，可作為高產(chǎn)種質(zhì)加以利用。通過(guò)表型聚類可有效地對(duì)煙草資源進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)。SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，期望雜合度(He)變化范圍為0.0974～0.8269，平均值為0.4700，He平均值小于0.5，說(shuō)明供試材料遺傳多樣性較低，這可能與海南省相對(duì)隔絕的地理位置有關(guān)；各品種間的遺傳相似性系數(shù)在0.143～1.000之間，聚類分析結(jié)果表明，供試種質(zhì)的親緣關(guān)系與地理來(lái)源相關(guān)性不大，這與前人多數(shù)研究結(jié)果一致[3,13-14]。通過(guò)12對(duì)SSR標(biāo)記構(gòu)建的指紋圖譜，為曬煙資源鑒定及新品種審定提供新思路。本研究通過(guò)表型性狀和分子標(biāo)記2種方法對(duì)海南煙草資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，得到的結(jié)果并不完全一致，這種情況在辣椒[17]、紅三葉[18]、梅花[19]等植物中也報(bào)道過(guò)。原因可能有以下2點(diǎn)：（1）形態(tài)學(xué)性狀易受外界環(huán)境條件影響導(dǎo)致鑒定結(jié)果出現(xiàn)一定的偏差；（2）所選的SSR位點(diǎn)可能與所調(diào)查的表型性狀不存在關(guān)聯(lián)，因而造成2種聚類結(jié)果的差異。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)高度重視“中式雪茄”的發(fā)展，雪茄煙已成為中國(guó)煙草行業(yè)新的增長(zhǎng)點(diǎn)。然而，國(guó)內(nèi)優(yōu)質(zhì)的雪茄煙原料絕大部分依賴于進(jìn)口，主要原因是品種匱乏和生態(tài)環(huán)境不適宜[20-21]。國(guó)內(nèi)的雪茄煙種質(zhì)資源僅占煙草種質(zhì)資源的3%，主要來(lái)源于地方優(yōu)質(zhì)晾曬煙品種篩選和國(guó)外優(yōu)良品種引進(jìn)。然而，篩選出的地方優(yōu)質(zhì)晾曬煙品種經(jīng)過(guò)多年種植種性退化較為嚴(yán)重，逐漸失去雪茄煙葉的應(yīng)有特征，國(guó)內(nèi)自然環(huán)境與原產(chǎn)地之間的差異也導(dǎo)致引進(jìn)的雪茄煙資源表現(xiàn)不出自身的特征特性[22-23]。因此，從地方優(yōu)質(zhì)晾曬煙種質(zhì)資源中發(fā)掘具有雪茄煙特性的種質(zhì)是解決品種單一問題的有效方法。氣象、土壤等生態(tài)因子是決定雪茄煙葉風(fēng)格特色的重要因素，適宜的自然環(huán)境是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉的基礎(chǔ)[24-25]。全球優(yōu)質(zhì)的雪茄煙葉生產(chǎn)基地均分布在南北回歸線之間，特別是23°N附近。海南省位于23°N以南地區(qū)，同古巴優(yōu)質(zhì)雪茄煙種植區(qū)VueltaAbajo地區(qū)和印度尼西亞東爪哇省Jember雪茄煙葉生產(chǎn)基地緯度相近，氣候相同，土壤富含有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)，理化特性類型也極為相近，被公認(rèn)為是國(guó)內(nèi)發(fā)展“中式雪茄”最具潛在優(yōu)勢(shì)的地區(qū)之一[20-21,26]。本研究對(duì)海南省收集到的23份煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了綜合分析，探索了種質(zhì)間的親緣關(guān)系，為基因挖掘及地方品種鑒定奠定了良好理論基礎(chǔ)，后期應(yīng)對(duì)其化學(xué)成分和感官評(píng)吸質(zhì)量等方面做進(jìn)一步研究，以期為“中式雪茄”研究提供優(yōu)質(zhì)育種材料。