鹽堿脅迫下外源H2O2對毛白楊生理特性的影響

任金蘭

（山西省關帝山國有林管理局屯蘭川林場，山西古交030208）

0 引言

土壤鹽堿化是造成土壤肥力降低的主要因素[1]。據(jù)報道，世界鹽堿化土壤面積達到了9.54×108hm2，中國鹽堿化土地面積也達到了3.7×107hm2，土壤鹽堿化已經成為毛白楊人工造林的限制因子[2]，研究外源過氧化氫對復鹽脅迫下毛白楊的生理響應機制，可以為毛白楊鹽堿地人工造林提供理論依據(jù)。從關帝山林區(qū)調研結果看，NaCl和NaHCO3是造成土壤鹽堿化的主要物質[3]。胡化廣[4]研究了鹽堿脅迫下結縷草生理變化，結果表明，結縷草CAT活性、脯氨酸含量、電導率均表現(xiàn)出升高的變化，SOD、可溶性糖表現(xiàn)出先升高后降低的變化；崔雪梅[5]研究認為，鹽堿脅迫抑制了油菜的生長，顯著提高了葉片內的可溶性糖含量，脯氨酸含量雖然升高但是與對照之間無顯著差異；張若晨[6]研究了鹽堿脅迫下大果櫸幼苗保護酶活性變化，結果表明，隨著鹽堿濃度的增加，POD、SOD活性表現(xiàn)出先升高后降低的變化；袁馳[7]研究了水稻對鹽堿脅迫的影響規(guī)律，結果表明，丙二醛、脯氨酸均隨著鹽堿濃度的增加而升高。鹽堿脅迫相關研究集中在鹽堿對植物種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響，關于鹽堿脅迫對植物生長季節(jié)影響的相關報道較少。毛白楊是山西省人工林建設的主要樹種[8]，研究毛白楊耐鹽堿的理論基礎具有重要的實踐意義。過氧化氫是植物響應環(huán)境脅迫的重要信號分子[9]，Bright[10-11]研究認為，外源 H2O2可以有效緩解逆境下黃瓜葉綠體膜的傷害；Andre-dias[12]研究認為，外源H2O2可以提高玉米的耐鹽性；劉建新[13]研究認為，H2O2提高了燕麥的耐堿性，這可能與外源H2O2會影響植物基因表達有關[14]。在前人的相關研究中鮮見鹽堿脅迫下外源過氧化氫對毛白楊生理響應機制影響的報道。筆者通過研究外源過氧化氫對鹽堿脅迫下毛白楊的生理活性物質的影響，探討外源過氧化氫提高植物抗逆性的機理，旨在為改進栽培措施提高毛白楊抗逆性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

室外試驗于2019年4—8月在屯蘭川林場試驗苗圃內全日光溫室內進行，室內生理指標測驗于取樣后第2～5天在生理生化實驗室內進行。

1.2 試驗材料

試驗所選毛白楊為1年生扦插苗，該苗木于2018年4月在苗圃內扦插育苗，至2019年4月自然條件下生長1年。2019年4月6日，人工用鐵鍬起苗，然后用自來水洗凈根系上的泥土，用吸水紙保濕備用。準備口徑32 cm、深40 cm的塑料盆，裝好珍珠巖，然后將洗凈的毛白楊苗木栽植其中，每盆栽植1株。栽植完成后，每盆澆500 mL的Hoagland營養(yǎng)液[15]，然后全部置于日光溫室內培養(yǎng)，每隔4天澆水1次，防止苗木發(fā)生干旱脅迫，一直培養(yǎng)至6月25日進行鹽堿脅迫處理。

1.3 試驗設計

試驗共設計4個處理，H1為對照，處理時澆灌等量的Hoagland營養(yǎng)液；H2為營養(yǎng)液與鹽堿溶液處理，Hoagland營養(yǎng)液+80 mmol/L NaHCO3+60 mmol/L NaCl；H3為鹽堿脅迫+過氧化氫處理，即Hoagland營養(yǎng)液+80mmol/LNaHCO3+60mmol/LNaCl+100μmol/L H2O2；H4為營養(yǎng)液+過氧化氫處理，即Hoagland營養(yǎng)液+100 μmol/L H2O2。自2019年6月25日開始，每盆澆灌試驗設計的溶液400 mL，每隔3天澆1次，澆灌3次后的第2天（即7月4日）取樣一次，澆灌6次后的第2天（即7月16日）取樣一次，測定各項生理指標變化情況。試驗所選用NaHCO3和NaCl均為分析純，所選用的H2O2為30%濃度。試驗每處理共30盆，3次重復，各處理在溫室內隨機排列。

1.4 試驗取樣及測定項目

分別于7月4、16日取樣，每處理隨機選擇6株苗木，將全部葉片摘取后放入液氮中冷凍保存，帶回實驗室后進行相關生理指標的測定。其中超氧陰離子測定采用羥胺氧化法[16]，H2O2含量測定采用分光光度法[17]，相對電導率采用電導儀法[16]，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[17]，SOD活性測定采用NBT光化還原法[18]，CAT活性測定采用紫外吸收法[18]，POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[18]，APX活性采用紫外分光光度法[18]，ASA含量測定采用紅菲咯啉比色法[18]，GSH含量測定采用TDNB法[18]，可溶性糖測定采用蒽酮比色法[18]，可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍法[18]，游離脯氨酸含量測定采用茚三酮法[18]。

1.5 試驗儀器及試劑

試驗所用紫外光分光光度計型號為2102C型，由尤尼柯（上海）儀器有限公司生產，2017年3月購入；茚三酮由上海芃碩生物科技有限公司生產，2019年1月購入；硫代巴比妥酸由上海源葉生物科技有限公司生產，2019年1月購入；30%過氧化氫由天津市大茂化學試劑廠生產，2019年3月購入；DDSJ-308A型電導率儀于2019年2月從上海儀電科學儀器股份有限公司購入。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析以及表格制作使用Excel 2010版軟件，方差分析使用DPS 7.05軟件。

2 結果與分析

2.1 外源H2O2對鹽堿脅迫下毛白楊超陰離子和內源H2O2含量的影響

由表1可知，隨著鹽堿溶液處理次數(shù)增加，超氧陰離子和過氧化氫含量增加，不同處理間存在差異。從超氧陰離子含量變化看，7月4日和7月16日，H2處理處于最高值，與H1處理相比分別提高了1.83、2.07 μg/g，差異顯著，說明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊葉片內的超氧陰離子含量；H3處理與H2處理相比分別降低了0.53、0.67 μg/g，差異顯著，表明外源H2O2可以降低葉片內超氧陰離子含量，效果顯著；H3與H4相比分別提高了1.36、1.45 μg/g，說明在相同H2O2處理下，鹽堿脅迫導致毛白楊超氧陰離子含量的顯著升高；H4處理分別低于H1處理0.06、0.07 μg/g，無顯著差異，說明一定濃度的外源H2O2不會對毛白楊葉片內的超氧陰離子產生顯著影響。從內源過氧化氫含量變化看，H2處理分別比H1處理提高了1.28、1.45 mg/g，差異顯著，說明鹽堿脅迫會顯著提高毛白楊葉片內的內源H2O2含量；H3處理分別比H2處理降低了0.71、0.69 mg/g，差異顯著，說明外源H2O2會顯著降低毛白楊葉片內源H2O2含量；H4處理分別低于H2處理0.12、0.16 mg/g，無顯著差異，說明外源H2O2在一定程度上會降低毛白楊葉片內內源H2O2含量，但是效果不顯著。

表1 毛白楊超氧陰離子和內源H2O2含量分析表

2.2 外源H2O2對鹽堿脅迫下毛白楊相對電導率和MDA含量的影響

由表2可知，隨著鹽堿溶液澆灌量的增加，毛白楊相對電導率和MDA含量均升高。從相對電導率變化看，7月4、16日，H2處理分別高于H1處理57.84和52.87個百分點，差異顯著，說明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊葉片內的相對電導率；H3處理分別比H2處理降低了7.50和4.53個百分點，無顯著差異，表明外源H2O2對緩解鹽堿脅迫降低相對電導率有一定的作用，但是效果不顯著；H4處理分別低于H1處理6.46和7.53個百分點，無顯著差異，表明外源H2O2對降低毛白楊葉片相對電導率具有一定的作用。從MDA含量變化看，H2處理分別比H1處理提高了7.90、9.73 nmol/g，差異顯著，說明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊葉片相對電導率；H3處理分別低于H2處理1.20、1.76 nmol/g，無顯著差異，說明外源H2O2有利于降低毛白楊的MDA含量；H4處理分別高于H1處理1.02、1.12 nmol/g，差異不顯著，說明外源H2O2一定程度上會提高毛白楊葉片內MDA含量，但是效果不顯著。H4處理相對電導率和MDA含量均顯著低于H2處理，并且與H1處理之間無顯著差異，說明外源H2O2對毛白楊的影響顯著小于鹽堿脅迫。從相對電導率和MDA含量變化看，外源H2O2一定程度上可以緩解鹽堿脅迫對毛白楊細胞膜的傷害。

表2 毛白楊相對電導率和MDA含量分析表

2.3 外源H2O2對鹽堿脅迫下毛白楊保護酶活性的影響

由表3可知，毛白楊葉片內保護酶活性隨著鹽堿處理次數(shù)的增加而升高，不同保護酶對外源H2O2的響應存在差異。從SOD活性變化看，7月4、16日H2分別比H1提高了5.88、9.13 U/g，差異顯著，說明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊葉片內的SOD活性；H3處理分別高于H2處理4.52、5.52 U/g，差異顯著，說明外源H2O2與無H2O2處理相比可以顯著提高SOD活性，對降低毛白楊鹽堿脅迫具有重要作用；H4處理分別高于對照3.10、4.36 U/g，無顯著差異，表明外源H2O2對提高毛白楊SOD活性具有一定的促進作用，但效果不顯著。H2處理POD活性與H1相比分別提高了1.67、6.85 U/g，H3處理分別比H2處理提高了3.11、1.28 U/g，差異顯著，說明外源H2O2對提高鹽堿脅迫下毛白楊POD活性效果顯著；H4處理POD活性與對照之間無顯著差異，說明外源H2O2與H1處理相比不會對毛白楊POD活性產生顯著影響。CAT活性變化與POD相同，其中H2處理分別高于H1處理1.10、1.81 U/g，差異顯著，說明鹽堿脅迫提高了毛白楊CAT活性；H3處理分別高于H2處理2.37、1.20 U/g，差異顯著，說明外源H2O2會對鹽堿脅迫下毛白楊CAT活性產生顯著影響；H4處理分別高于H1處理0.28、0.15 U/g，無顯著差異，說明外源H2O2與H1處理相比不會顯著影響毛白楊CAT活性。鹽堿脅迫提高了毛白楊APX活性，其中H2處理分別比H1處理提高了2.30、2.20 U/g，差異顯著；H3處理分別高于H2處理3.20、3.18 U/g，差異顯著，表明外源H2O2對提高APX活性具有顯著作用；H4處理分別高于H1處理0.77、0.65 U/g，無顯著差異，說明一定濃度的外源H2O2不會對APX產生顯著影響。

表3 毛白楊保護酶活性變化分析表 U/g

2.4 外源H2O2對鹽堿脅迫下毛白楊活性氧清除系統(tǒng)的影響

由表4可知，AsA和GSH含量隨著鹽堿處理次數(shù)的增加而升高，不同處理對2種生理活性物質含量的影響也存在差異。7月4、16日，H2處理AsA分別高于H1處理0.25、0.27 mg/g，無顯著差異，說明鹽堿脅迫提高了AsA含量，但效果不顯著；H3處理分別高于H2處理0.76、0.86 mg/g，無顯著差異，說明外源H2O2與鹽堿脅迫處理相比對提高AsA含量有一定作用，但是效果不顯著，與H1處理相比顯著提高了AsA含量；H4處理分別比H1處理提高了2.40、2.21 mg/g，差異顯著，說明外源H2O2與H1處理相比顯著提高了AsA含量。GSH含量變化與AsA存在差異，其中H2處理分別比H1處理提高了0.08、0.10 mg/g，差異顯著，說明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊葉片內GSH含量；H3處理分別低于H2處理0.02、0.03 mg/g，無顯著差異，表明外源H2O2對降低鹽堿脅迫下GSH含量有一定的作用；H4處理分別低于H1處理0.06、0.04 mg/g，其中7月4日差異顯著，說明外源H2O2與H1處理相比對降低毛白楊葉片GSH含量具有一定的作用。

表4 毛白楊AsA和GSH含量分析表 mg/g

2.5 外源H2O2對鹽堿脅迫下毛白楊滲透物質含量的影響

由表5可知，隨著鹽堿脅迫處理次數(shù)的增加，毛白楊滲透物質含量升高，不同處理對滲透物質含量的影響存在差異。7月4、16日，H2處理可溶性糖含量分別比H1處理提高了96.74、110.82 mg/g，差異顯著，表明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊可溶性糖含量；H3處理分別低于H2處理29.82、27.27 mg/g，其中7月4日2個處理之間差異顯著，7月16日差異不顯著，說明外源H2O2有利于緩解鹽堿脅迫并降低可溶性糖含量；H4處理分別高于H1處理14.92、9.58 mg/g，其中7月4日差異顯著，7月16日差異不顯著，同時，H4處理顯著低于H2、H3處理。H2處理可溶性蛋白含量分別高于H1處理1.45、0.97 mg/g，差異顯著，表明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊可溶性蛋白含量；7月4日，H3處理高于H2處理1.66 mg/g，差異顯著，表明外源H2O2在7月4日可以顯著提高毛白楊葉片內可溶性蛋白含量，7月16日H3處理低于H2處理0.56 mg/g，無顯著差異，表明外源H2O2在7月16日不會對可溶性蛋白產生顯著影響。游離脯氨酸含量H2處理分別高于H1處理3.87、3.56 mg/g，差異顯著，表明鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊滲透物質含量；H3處理分別高于H2處理5.85、8.11 mg/g，差異顯著，表明外源H2O2與鹽堿脅迫處理相比顯著提高了毛白楊游離脯氨酸含量；H4處理分別比H1處理提高了2.42、4.56 mg/g，差異顯著，表明外源H2O2會顯著提高毛白楊游離脯氨酸含量。

表5 毛白楊滲透物質含量分析表 mg/g

3 結論

（1）鹽堿脅迫會顯著提高毛白楊葉片內超氧陰離子和過氧化氫含量，外源H2O2處理與鹽堿脅迫處理相比顯著降低了超氧陰離子和過氧化氫含量，外源H2O2處理與對照相比不會對超氧陰離子和過氧化氫含量產生顯著影響。

（2）鹽堿脅迫會顯著提高毛白楊相對電導率和MDA含量，外源H2O2會降低相對電導率，對MDA含量影響不顯著；外源H2O2與對照相比不會對相對電導率和MDA含量產生顯著影響。

（3）鹽堿脅迫顯著提高了SOD、APX活性，外源H2O2與鹽堿脅迫處理相比均可以提高毛白楊保護酶活性；外源H2O2與對照相比不會對SOD和APX活性產生顯著影響，顯著提高POD、CAT活性。

（4）鹽堿脅迫不會顯著影響AsA含量，外源H2O2與鹽堿處理相比提高了AsA含量，與對照相比提高效果顯著；鹽堿脅迫顯著提高了GSH含量，外源H2O2與鹽堿脅迫處理相比降低了GSH含量，外源H2O2與對照相比不會對GSH含量產生顯著影響。

（5）鹽堿脅迫顯著提高了毛白楊可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量，外源H2O2與鹽堿脅迫處理相比降低了可溶性糖含量，顯著提高了可溶性蛋白、游離脯氨酸含量；外源H2O2與對照相比顯著提高毛白楊滲透物質含量。

（6）從毛白楊抗逆機理看，外源H2O2可以緩解鹽堿脅迫，提高活性氧清除系統(tǒng)活性，調節(jié)滲透平衡。

4 討論

武敬亮[19]研究認為，植物在鹽堿脅迫下膜脂過氧化水平會顯著升高，使植物細胞膜受到破壞，從而影響其功能的發(fā)揮，嚴重時植物會死亡。本試驗研究中，鹽堿脅迫均顯著提高了毛白楊超氧陰離子和內源H2O2含量，說明鹽堿脅迫導致氧負基離子的積累，而過多的氧負離子積累不僅會對細胞膜系統(tǒng)造成不可逆的傷害，也會嚴重抑制光合作用的進行，從而影響植物的正常生長發(fā)育[20]。外源H2O2可以顯著降低超氧陰離子和內源過氧化氫含量，從而降低毛白楊相對電導率，延緩MDA積累，這與劉建新[21]的研究結果相似，說明外源H2O2對降低毛白楊鹽堿脅迫下膜脂過氧化水平，以保護膜系統(tǒng)不受傷害，維持植物體正常生理代謝的進行。從SOD的作用看，其活性的提高可以將更多的超氧陰離子轉化為過氧化氫和氧氣，而其他保護酶通過協(xié)同作用將過氧化氫轉化為水，AsA和GSH直接參與過氧化氫的轉化，因此保護酶活性的提高可以防止植物遭受逆境傷害[22]。本研究中，外源H2O2均提高了毛白楊各保護酶活性，其中SOD和APX均達到了顯著水平，說明外源過氧化氫在一定程度上可以提高超氧負離子和內源過氧化氫的轉化效率，從而緩解毛白楊在鹽堿脅迫下受到的傷害[23]。谷文英[24]研究認為，保護酶活性提高可以促進鹽堿脅迫下植物逆境蛋白的表達，從而有利于植物抗逆性提高；從毛白楊鹽堿脅迫生理響應機制看，SOD、POD、APX、CAT在鹽堿脅迫下均會顯著升高，這與張曉龍[25]的研究結果相似，表明逆境脅迫下植物保護酶活性升高是毛白楊對鹽堿脅迫的重要生理響應機制。張波[26]研究認為，外源H2O2對提高小麥可溶性糖含量效果顯著，同時也可以顯著提高GSH含量來提高植株的抗逆能力，而本研究與之存在差異，這可能與不同植物對外源過氧化氫的生理響應機理不同有關。從本試驗研究結果看，外源H2O2顯著提高了可溶性蛋白含量，對提高其抗鹽堿能力具有重要作用，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，除外源H2O2能促進抗逆蛋白表達有關外，還與外源H2O2抑制活性氧產生，從而影響蛋白酶活性升高抑制了可溶性蛋白降解有關[27]。外源H2O2提高了毛白楊游離脯氨酸含量，這與武術杰[28]的研究結果相似，這與外源H2O2可以激活谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑促進游離脯氨酸的合成有關[29]。本研究探討了毛白楊對外源H2O2對鹽堿脅迫下毛白楊的生理響應機制，在后續(xù)的研究中，需要圍繞毛白楊生理變化的機理進行深入研究，這對填補相關的基礎理論研究空白具有一定意義。