基于多元統(tǒng)計(jì)分析的產(chǎn)地制何首烏品質(zhì)評(píng)價(jià)研究

姜建輝，張志強(qiáng)，湯丹丹，夏清（四川中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，四川 綿陽(yáng) 621000）

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根，中醫(yī)臨床常用何首烏和制何首烏入藥。何首烏具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便的功效；制何首烏具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)和強(qiáng)筋骨的功效。用于血虛萎黃，眩暈耳鳴，須發(fā)早白，腰膝酸軟，肢體麻木，崩漏帶下和久瘧體虛等[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，何首烏具有多種藥理活性[2]，如抗衰老[3]、增強(qiáng)免疫能力[4]、抗腫瘤[5]和抗抑郁[6]等。《中國(guó)藥典》2015年版收載了乙肝寧顆粒、七寶美髯顆粒等59 種含何首烏和制何首烏的單方或成方制劑[7]，臨床使用量較大。

川產(chǎn)何首烏的記載始于清·雍正《敘州府志》：“藥材有何首烏”[8]。現(xiàn)今何首烏在四川的分布更為廣泛，品種優(yōu)良，產(chǎn)量宏豐，是川產(chǎn)道地藥材之一[9]。金堂、雅安、瀘州、樂(lè)山、涼山州和遂寧等地是四川何首烏的主要產(chǎn)區(qū)。在對(duì)川產(chǎn)何首烏質(zhì)量的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，對(duì)制何首烏的質(zhì)量評(píng)價(jià)鮮有報(bào)道，對(duì)何首烏的質(zhì)量評(píng)價(jià)較多，其中二苯乙烯苷類指標(biāo)成分的含量差異甚大，如邢加慧等[10]測(cè)得四川何首烏中二苯乙烯苷含量為3.92%，而沈亞芬等[11]測(cè)得四川何首烏中二苯乙烯苷含量?jī)H為0.101%，未達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)（二苯乙烯苷含量不少于1%）。

本課題組前期已采集四川金堂、遂寧、雅安、樂(lè)山和西昌5 個(gè)不同產(chǎn)地的何首烏藥材，同時(shí)以二苯乙烯苷和游離蒽醌為指標(biāo)成分，對(duì)何首烏生品質(zhì)量進(jìn)行科學(xué)、客觀的評(píng)價(jià)。為了更加合理評(píng)價(jià)川產(chǎn)制何首烏質(zhì)量，完善川產(chǎn)道地藥材生產(chǎn)區(qū)劃，本課題擬在前期研究基礎(chǔ)上，按照《中國(guó)藥典》（2015年版）制何首烏項(xiàng)下以黑豆汁拌勻后蒸法炮制5 個(gè)不同產(chǎn)地的何首烏，并采用主成分分析（PCA）和TOPSIS 分析法對(duì)制何首烏中二苯乙烯苷、游離蒽醌、灰分和醇溶性浸出物等指標(biāo)進(jìn)行較為全面的評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 儀器

DGU-20A 島津液相色譜儀（日本島津公司）；ATY124 萬(wàn)分之一電子天平（日本島津公司）；SX2-9-12TP 馬氟爐（上海超泓儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品二苯乙烯苷（批號(hào)：T110192，純度≥98.0%）、大黃素（批號(hào)：E106693，純度≥98.0%）、大黃素甲醚（批號(hào)：P111308，純度≥98.0%）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；色譜乙腈（德國(guó)默克股份有限公司）；水為超純水；其他試劑為分析純。

何首烏藥材來(lái)源見(jiàn)表1，經(jīng)四川中醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥用植物教研室任勁松老師鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根。參照《中國(guó)藥典》2015年版中的方法對(duì)四川5 個(gè)產(chǎn)地的何首烏進(jìn)行炮制，得制何首烏。

表1 藥材來(lái)源Tab 1 Source of medicinal materials

2 方法與結(jié)果

2.1 二苯乙烯苷、游離蒽醌含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 在朱培芳等[12]的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，色譜柱：Wondasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（見(jiàn)表2）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1 mL·min－1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚及供試品溶液的HPLC 圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品（A）和供試品（B）的HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference（A）and sample（B）

表2 梯度洗脫表Tab 2 Gradient elution

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取二苯乙烯苷對(duì)照品10.01 mg、大黃素對(duì)照品4.61 mg 和大黃素甲醚對(duì)照品4.38 mg，甲醇定容，制成質(zhì)量 濃 度 分 別 為400.35、61.47 和29.2 μg·mL－1的儲(chǔ)備液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別取制何首烏粉末（過(guò)四號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，上清液濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量配制成系列混合對(duì)照品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。逐級(jí)稀釋混合對(duì)照品母液，按信噪比（S/N）＝10 計(jì)算定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 線性關(guān)系和定量限Tab 3 Linearity and limit of quantitation

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取適量二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6 次，計(jì)算得二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為3.4%、0.90%和2.6%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取西昌制何首烏，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算得二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚含量的RSD分別為4.1%、0.80%和1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取西昌制何首烏，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于1、3、5、7、12、24 h 進(jìn)樣，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算得二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為4.3%、1.0%和1.8%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的西昌制何首烏0.25 g，加入相當(dāng)于樣品中3種成分含量80%、100%、120%的對(duì)照品，各3 份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率。二苯乙烯苷低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為96.5%、101.3%和97.7%，RSD值分別為2.7%、2.9%和3.1%；大黃素低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為97.7%、95.3%和102.7%，RSD值分別為1.5%、3.5%和2.2%；大黃素甲醚低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為96.8%、99.7%和95.7%，RSD值分別為1.6%、2.1%和2.0%。

2.1.9 樣品含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地制何首烏粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚的含量。

2.2 灰分的測(cè)定

灰分的測(cè)定方法按《中國(guó)藥典》2015年版第四部（通則2302）項(xiàng)下[1]收載的方法進(jìn)行。按公式（1）計(jì)算供試品中總灰分的百分含量，按公式（2）計(jì)算供試品中酸不溶性灰分的含量（%），按公式（3）計(jì)算供試品中生理灰分的含量（%）。

2.3 醇浸出物的測(cè)定

醇浸出物的測(cè)定方法按《中國(guó)藥典》2015年版第四部（通則2201）項(xiàng)下[1]收載的方法進(jìn)行。除另有規(guī)定外，以干燥品按公式（4）計(jì)算供試品中醇浸出物的含量（%）。

3 結(jié)果與分析

3.1 制何首烏中二苯乙烯苷、游離蒽醌、灰分和醇浸出物的含量

川產(chǎn)制何首烏中二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚、灰分和醇浸出物的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。二苯乙烯苷的含量為0.63%～3.67%，大黃素含量為0.14%～0.23%，大黃素甲醚含量為 0.13%～0.17%，游離蒽醌的含量為0.30%～0.36%。不同產(chǎn)地制何首烏中二苯乙烯苷的含量差異較大，而游離蒽醌的含量相當(dāng)。總灰分的含量為1.88%～4.46%，酸不溶性灰分為0.12%～0.47%，生理灰分為1.75%～4.05%。醇浸出物的含量為1.72%～11.85%。不同產(chǎn)地的制何首烏醇浸出物含量差異較大。

表4 不同產(chǎn)地制何首烏中二苯乙烯、游離蒽醌、灰分和醇浸出物的二含量測(cè)定結(jié)果(%，±s，n ＝3)Tab 4 Content of stilbene glycosides，free anthraquinone (based on the total amount of emodin and emodin methyl mther)，ash content and extract of Polygoni Multiflori Radix Praeparata (%，±s，n ＝3)

表4 不同產(chǎn)地制何首烏中二苯乙烯、游離蒽醌、灰分和醇浸出物的二含量測(cè)定結(jié)果(%，±s，n ＝3)Tab 4 Content of stilbene glycosides，free anthraquinone (based on the total amount of emodin and emodin methyl mther)，ash content and extract of Polygoni Multiflori Radix Praeparata (%，±s，n ＝3)

注：不同產(chǎn)地間兩兩比較，不同的字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。Note：Different letters indicate that the difference between different origins by pairwise comparisons is statistically significant（P ＜0.05）.

編號(hào) 產(chǎn)地 二苯乙烯苷 游離蒽醌 總灰分 酸不溶性灰分 生理灰分 醇浸出物大黃素 大黃素甲醚12345金堂西昌雅安樂(lè)山遂寧2.71±0.09b 3.67±0.05a 0.65±0.05d 0.63±0.04d 1.66±0.06c 0.18±0.01a 0.23±0.01a 0.14±0.02a 0.15±0.01a 0.22±0.02a 0.15±0.01a 0.13±0.01a 0.15±0.01a 0.17±0.01a 0.13±0.01a 3.04±0.04c 3.76±0.02 b 4.46±0.01 a 1.88±0.02d 3.03±0.04c 0.15±0.01c 0.26±0.02b 0.47±0.01a 0.12±0.01c 0.26±0.01b 2.85±0.03c 3.51±0.04b 4.05±0.12a 1.75±0.04d 2.76±0.01c 6.26±0.12b 11.85±0.23a 4.29±0.04c 1.72±0.02d 4.28±0.06c

3.2 PCA

應(yīng)用 SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)制何首烏的成分測(cè)定結(jié)果進(jìn)行主成分分析[11]，分析結(jié)果如表5所示。制何首烏中特征值＞1 的主成分有兩個(gè)，其累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)94.985%，基本可以客觀反映制何首烏的樣本信息。總灰分和生理灰分在第一主成分有較高載荷，表明第一主成分基本可以反映這兩個(gè)成分的信息，成高度正相關(guān)；游離蒽醌在第二主成分有較高載荷，表明第二主成分基本反映了游離蒽醌的信息，成高度正相關(guān)。據(jù)得分系數(shù)矩陣結(jié)果，何首烏各主成分得分模型為F1＝0.5308X1＋0.404X2＋0.5375X3＋0.4198X4＋0.2812X5＋0.1048X6，F(xiàn)2＝－0.2073X1－0.4124X2－0.1835X3＋0.399X4＋0.528X5＋0.5618X6，綜合得分模型為F＝0.200 65X1＋0.038 96X2＋0.215X3＋0.4105X4＋0.391 59X5＋0.309 22X6；根據(jù)主成分綜合模型以標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)計(jì)算綜合主成分值，并對(duì)其按綜合主成分值進(jìn)行排序[13]：西昌（1.8045）＞金堂（0.1841）＞遂寧（－0.07404）＞雅安（－0.3409）＞樂(lè)山（－1.5736），表明西昌制何首烏質(zhì)量最佳。

表5 制何首烏中主成分分析結(jié)果Tab 5 Principal component analysis of Polygoni Multiflori Radix Praeparata

3.3 TOPSIS 分析

根據(jù)各指標(biāo)成分權(quán)重結(jié)果，以標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)采用DPS 軟件進(jìn)行TOPSIS 分析，按得分進(jìn)行排名，結(jié)果見(jiàn)表6。西昌（0.7261）＞金堂（0.5722）＞樂(lè)山（0.3343）＞遂寧（0.2948）＞雅安（0.1503），表明西昌的制何首烏質(zhì)量最優(yōu)。

表6 制何首烏TOPSIS 評(píng)價(jià)的結(jié)果Tab 6 TOPSIS of Polygoni Multiflori Radix Praeparata

4 討論

本研究對(duì)四川5 個(gè)產(chǎn)地的制何首烏中灰分、醇浸物、二苯乙烯苷和游離蒽醌進(jìn)行測(cè)定。采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定3 種成分的含量，操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠，具有良好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，可為制何首烏的全面品質(zhì)評(píng)價(jià)提供有效的方法。

多元統(tǒng)計(jì)分析能更全面、更準(zhǔn)確地控制中藥的質(zhì)量，在中藥資源的質(zhì)量評(píng)價(jià)、成分淺析、真?zhèn)舞b別等方面運(yùn)用廣泛。主要使用的方法有主成分分析、因子分析、聚類分析等[14]。本研究采用PCA 和TOPSIS 分析法對(duì)測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。主成分分析和 TOPSIS 分析得到各地制何首烏的質(zhì)量評(píng)價(jià)排名有差異，但對(duì)于排名靠前的樣品，兩種方法得到一致的結(jié)果：西昌最優(yōu)，金堂次之。可見(jiàn)，PCA 和 TOPSIS 分析法對(duì)產(chǎn)地影響較大的數(shù)據(jù)分析可得到基本一致的排名結(jié)果。