UPLC-MS/MS法測定小兒瀉痢片中7種有效成分的含量

張峰，趙玉泉，李習瑩（開封市食品藥品檢驗所，河南 開封 475000）

小兒瀉痢片是由葛根、黃芩、白芍、甘草等十味中藥材經提取濃縮等工藝制成的片劑，其主要用于治療小兒濕熱下注所致的痢疾、泄瀉[1]。小兒瀉痢片的功效是多種活性成分共同作用的結果，其中有效成分葛根素能改善心肌代謝及血管微循環、擴張冠狀血管[2]；黃芩苷可以抑菌、利尿、抗炎、抗變態及解痙作用；厚樸酚與和厚樸酚具有抑制癌細胞轉移、抗血小板聚集等作用[3]；鹽酸小檗堿對痢疾桿菌、大腸埃希菌所引發的腸道感染具有抗感染作用；芍藥苷具有平抑肝陽、養血調經、斂陰止汗、抗菌之功效[4]；甘草酸有抗炎、增強免疫力、抗冠狀病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和人巨細胞病毒等呼吸道病毒的功能[5]。因此，對小兒瀉痢片主要活性成分進行多組分同時檢測，可以全面反映其質量。

現行質量標準僅對黃芩苷進行質量控制，無法全面反映小兒瀉痢片復方制劑的特點，也無法實現有效全面的質量控制。目前關于小兒瀉痢片質量控制的研究較多[6]，但大多采用液相色譜法結合紫外檢測器進行測定，且檢測的活性成分僅為一個或幾個，方法分離效果不佳、運行時間長、專屬性差。近幾年發現偽品刺果甘草與甘草混合售賣，原標準[1]尚未收載對甘草的鑒別試驗，且尚無文獻報道對小兒瀉痢片中甘草的含量進行質量控制。因為甘草酸的濃度很低，無法采用HPLC 法進行定量分析。因中藥制劑成分復雜，使用HPLC 法測定時待測組分很難有效分離，且分析時間較長致使峰寬過寬難以得到較好的峰形。因此，選擇更高效靈敏的儀器來建立快速、準確、選擇性好的檢測方法十分必要。

UPLC-MS/MS 法有著專屬性強、靈敏度高的特點，它能通過不同化合物的特征母離子和子離子的相對應使之抗干擾能力強[7]，同時實現分離和鑒定的作用，更好地解決復雜樣品準確定性、定量的問題，故本文采用UPLC-MS/MS 法同時測定小兒瀉痢片中葛根素、黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、厚樸酚、和厚樸酚與甘草酸7 種活性成分的含量，為小兒瀉痢片的質量控制及評價提供參考。

1 儀器與試藥

美國Waters 三重四級桿液質聯用儀（ACQUITY UPLC H-Class Plus Xevo TQ-S Micro，離子源為ESI 源）；New Classic 電子天平（德國Mettler Toledo，十萬分之一），KQ-300 GDV 超聲儀（昆山超聲儀器有限公司），優普ULUP 超純水機（四川優普超純科技有限公司）。甲酸、乙腈均為質譜純（Fisher 公司），甲醇為色譜純（默克公司），對照品芍藥苷（批號：110736-201035，純度：96.5%）、厚樸酚（批號：110729-201310，純度：100.0%）、和厚樸酚（批號：110730-201614，純度：99.3%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，純度：96.2%）、黃芩苷（批號：110715-201016，純度：93.3%）、鹽酸小檗堿（批號：110713-201613，純度：86.8%）、葛根素（批號：110752-201615，純度：95.4%）（中國食品藥品檢定研究院），小兒瀉痢片（糖衣片，片芯重0.17 g，批號：1911032、1912121、2001221，桂林三金藥業股份有限公司）；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件和質譜條件

色譜柱為phenomenex kinetex C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm），流動相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），流速為0.4 mL·min－1，梯度洗脫（0～0.5 min，10%B；0.5～2 min，70%～30%%B；2～7.5 min，20%～80%B；7.5～7.6 min，10%B；7.6～15 min，10%B），柱溫為35℃，進樣量為2 μL。

離子源：ESI 源，正負離子切換掃描，MRM模式；毛細管電壓：3.2 kV，錐孔電壓：50 V；離子源溫度：150 ℃；干燥氣溫度：400 ℃，氣體流量800 L·h－1；霧化器壓力240 kPa；霧化氣、干燥氣均為N2，Ar 為碰撞氣，質譜其余分析參數見表1。

表1 7 種成分的質譜參數Tab 1 MS parameters of 7 components

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品溶液的配制 精密稱取葛根素、芍藥苷、鹽酸小檗堿、厚樸酚、和厚樸酚與甘草酸對照品各約10 mg，分別置于10 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，作為對照品儲備液，質量濃度均約為1 g·L－1；精密稱取黃芩苷約10 mg，置20 mL 量瓶中，分別吸取上述6 種對照品儲備液適量，置該量瓶中，用40%乙腈溶液稀釋至刻度，作為混合對照品溶液①，其中葛根素、黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、厚樸酚、和厚樸酚與甘草酸的質量濃度分別為0.1010、0.5010、0.1024、0.2008、0.1022、0.0505 與0.0303 g·L－1。精密量取混合對照品溶液①2 mL，置100 mL 量瓶中，用40%乙腈溶液稀釋至刻度，作為混合對照品溶液②，精密量取混合對照品溶液②1、2、3、5、10、15 mL 分別置于50 mL 量瓶中，用40%乙腈溶液稀釋至刻度，制成系列濃度的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取本品20 片，除去包衣，精密稱定，研細，精密稱取約0.2 g，置100 mL 錐形瓶中，加入50 mL 70%乙醇溶液，浸漬12 h 后，超聲（500 W，40 kHz）提取30 min，上清液轉移至200 mL 量瓶中，殘渣加入30%乙醇溶液約50 mL，超聲提取30 min，過濾，合并濾液，殘渣用50 mL 30%乙醇溶液分次洗滌，最后用30%乙醇溶液稀釋到刻度，精密量取續濾液5 mL，置50 mL 量瓶中，用40%乙腈溶液稀釋至刻度，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.3 方法學

2.3.1 方法專屬性試驗 取“2.2.1”項下中間濃度的混合對照品溶液和“2.2.2”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結果各組分峰形良好，無干擾成分。各待測組分的MRM 圖譜見圖1，二級質譜圖見圖2。

圖1 對照品（a）和供試品（b）的MRM 色譜圖Fig 1 Multiple reaction monitoring（MRM）chromatogram of the seven standards（a）and sample（b）

圖2 小兒瀉痢片中各組分的二級質譜圖Fig 2 Secondary mass spectrogram of 7 components in Xiaoer Xieli tablets

2.3.2 線性關系的考察 取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下條件進樣，記錄峰面積，用外標法計算，以7 個待測組分的質量濃度為橫坐標，其對應的色譜峰峰面積為縱坐標，進行線性回歸計算，結果見表2。

表2 小兒瀉痢片中7 種成分的線性關系Tab 2 Linear correlation of 7 components in Xiaoer Xieli tablets

2.3.3 重復性試驗 取批號為1911032 的供試品6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件進行測定，7 個待測組分測得含量的均值分別為葛根素0.4588 mg/片、黃芩苷2.671 mg/片、芍藥苷0.4775 mg/片、鹽酸小檗堿0.9765 mg/片、厚樸酚0.4669 mg/片、和厚樸酚0.2340 mg/片與甘草酸0.1367 mg/片，RSD值分別為葛根素1.5%、黃芩苷1.8%、芍藥苷3.2%、鹽酸小檗堿1.0%、厚樸酚1.7%、和厚樸酚2.3%與甘草酸1.6%，結果表明本方法重復性符合要求。

2.3.4 穩定性試驗 取“2.3.3”項下供試品溶液，按“2.1”項下條件在0、2、5、10、15、20、24 h 分別進樣，記錄峰面積，7 個待測組分峰葛根素、黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、厚樸酚、和厚樸酚與甘草酸，峰面積的RSD值分別為1.7%、1.9%、3.9%、1.3%、2.0%、2.5%和1.9%，結果表明各組分在24 h 內穩定。

2.3.5 精密度試驗 分別精密吸取“2.2.1”項下中間濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下條件進樣，連續進樣7 次，記錄峰面積，結果葛根素、黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、厚樸酚、和厚樸酚與甘草酸峰面積的RSD值分別為2.3%、1.7%、3.7%、1.6%、2.1%、1.9%和1.7%，表明該儀器精密度滿足試驗要求。

2.3.6 回收試驗 分別取已知含量的批號為1911032 的供試品6 份，每份約0.11 g，精密稱定，分別置200 mL 量瓶中，精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液①1、2 和3 mL，平行2 份，按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，按“2.1”項下條件測定回收率。結果7 個待測組分的平均加樣回收率分別為葛根素101.8%（RSD為1.2%）、黃芩苷99.8%（RSD為3.9%）、芍藥苷95.5%（RSD為2.8%）、鹽酸小檗堿106.9%（RSD為2.5%）、厚樸酚97.2%（RSD為3.8%）、和厚樸酚95.5%（RSD為3.4%）與甘草酸104.3%（RSD為3.6%）。

2.3.7 樣品含量測定 取3 個批號的供試品各2 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下條件進行測定，含量測定結果見表3。

表3 含量測定結果(mg/片)Tab 3 Content determination (mg/片)

3 討論

參考文獻[8-10]中葛根素、黃芩苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、厚樸酚、和厚樸酚與甘草酸的提取方法有超聲波提取法、浸漬法、回流提取法，提取溶劑也不盡相同。本文分別用30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇及30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇結合超聲提取法提取樣品，發現采用同樣含水量的甲醇和乙醇提取效率相當，但不同含水量的溶劑提取出來的待測組分差別較大。因乙醇無毒便宜，故本文采用乙醇作為溶劑，且考慮到苷類和黃酮類化合物有較高的水溶性，而其他組分使用70%乙醇溶液提取率最高，故綜合考慮采用70%乙醇溶液和30%乙醇溶液分次提取。通過對比70%乙醇溶液浸漬12 h 后分次超聲提取和回流提取，發現待測物含量無明顯變化，故采用較為簡便的浸漬12 h 后分次超聲提取法。分別使用超聲提取20 min、30 min、60 min，發現待測物超聲提取30 min 時的含量與60 min 時的相當。綜合考慮提取方法如下，樣品用70%乙醇溶液浸漬12 h 后超聲提取30 min，濾過，濾渣再用30%乙醇溶液超聲提取30 min。

參考文獻[11-15]采用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-10 mmol·L－1甲酸銨溶液進行梯度洗脫，發現各物質在乙腈-0.1%甲酸溶液中響應良好且有較好的峰形。由于在使用40%乙腈溶液稀釋時溶劑效應最小，故選用40%乙腈溶液稀釋樣品。為保證本法具有合適的定量限，使用含量最低的甘草酸的質譜條件作為最優化條件，且根據響應值的高低采用了正負離子切換掃描的方式，采集模式選擇MRM 對待測樣品進行掃描，將豐度最大的子離子作為定量離子，保證了方法的專屬性和準確性。

通過測定3 批樣品的含量，發現每批待測組分的含量比值差別較大，藥品的均一性和一致性難以保證，本文為標準提高提供了數據支撐。

本試驗首次建立了UPLC-MS/MS 法同時測定小兒瀉痢片中7 種有效成分的含量，本法節省溶劑、快速準確、靈敏度高、專屬性強，為該藥品質量標準的提高提供參考。