梔子主要有效成分的代謝及毒性研究進展

高雨，朱琦，陳蕾蕾，王子桐，曹正弦，黃昊妍，張永杰，陳西敬（中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學學院 臨床藥物代謝動力學研究室，南京 211198）

中藥材梔子來源于茜草科植物梔子（Gardenia jasminoidesEllis）的干燥成熟果實[1]，始載于《神農本草經》，其味苦，性寒，歸心、肺、三焦經，臨床主治熱病煩渴、肝火目赤、濕熱黃疸、血熱出血、瘡瘍腫毒等。此外，作為衛生部頒布的第一批藥食兩用資源，梔子的使用十分廣泛，如香附梔子粥、梔子茶、菊苣梔子茶等。

梔子果實的化學成分繁多，將其歸納如表1所示[2-4]。其中與梔子藥理學功效密切相關的是以梔子苷為代表的環烯醚萜類成分，以藏紅花酸（西紅花酸）為代表的二萜類成分，以及以綠原酸為代表的有機酸酯類成分。幾種有效成分中又以梔子苷含量最高[3-4]，被公認為梔子中最重要的活性成分；因此基于梔子苷的藥效[5-7]、代謝和毒性[8-10]等的研究也最為廣泛。

表1 梔子果實的主要成分[2-4]Tab 1 Main components of Fructus Gardeniae[2-4]

近年來，梔子毒性越來越受到關注。中藥古籍中就有關于梔子“苦寒傷胃”的藥性記載。如《本草經疏》中提到：“梔子稟至苦大寒之氣，苦寒損胃而傷血，凡脾胃虛弱者忌之”。2017年，國家食品藥品監督管理總局曾發布關于修訂茵梔黃口服制劑說明書的公告，明確說明了服用茵梔黃口服制劑會引起腹瀉、嘔吐等不良反應。此外，近年來，許多研究發現實驗動物長期大劑量灌服梔子提取物后出現不同程度的肝腎毒性反應[11-13]，提示梔子有潛在的肝腎毒性。而梔子毒性的物質基礎與其有效成分在體內的代謝密切相關。現將梔子主要有效成分的代謝、毒性特征及毒性機制研究進展綜述如下。

1 梔子主要有效成分的體內代謝研究進展

近年來，關于梔子有效成分的體內代謝研究多集中于以梔子苷為代表的環烯醚萜苷類成分，其已發現的主要代謝路徑如圖1所示。

圖1 梔子主要有效成分的代謝途徑[14-28]Fig 1 Metabolic pathways for main effective components of Fructus Gardeniae[14-28]

1.1 在胃腸道的代謝

梔子作為常用天然藥物，其給藥方法一般為熬煮后口服。而經口服途徑給予的很多臨床用藥，特別是中草藥，其成分會受到胃液和腸道菌群的影響。

Miyagoshi 等[14]研究表明，梔子苷在胃液中（37 ℃，pH ＝1.8）沒有發生改變，說明胃液環境對梔子苷沒有影響。而羥異京尼平苷則在胃液中發生異構化，生成雞屎藤次苷甲酯（SSM）和去乙酰車前草酸甲酯（DAM），且兩者生成速率比為1∶8。

Kawata 等[15]篩選了25 種人體腸道菌群，將其分別在梔子苷和NH4Cl 存在條件下的厭氧環境中培養后分析，確定桅子苷代謝產物中含有京尼平及2 個新化合物，說明梔子苷在腸道菌群作用下會分解為苷元。而在具有β-D-葡萄糖苷酶和酯酶活性的大鼠肝臟勻漿中加入 KCl 及梔子苷，并在pH 7.2 的磷酸鉀緩沖液中進行培養，沒有檢測到京尼平，說明梔子苷并沒有經肝臟中的代謝酶分解[16]，由此推測梔子苷很可能只在腸道菌群作用下轉化為京尼平。

京尼平在腸道會進一步被酯酶水解為梔子酸苷元[16]，梔子酸也在β-D-葡萄糖苷酶的作用下脫糖基生成梔子酸苷元；羥異京尼平苷在胃液中異構化生成的SSM 和DAM，也在腸道內進一步脫糖基[14]。將京尼平龍膽雙糖苷在大鼠腸道菌群和大鼠原代肝細胞中分別培養，結果表明，京尼平龍膽雙糖苷也在腸道內脫去糖基生成梔子苷和京尼平，梔子苷可進一步脫糖基生成京尼平[17]。

由此可見，梔子中的環烯醚萜類成分經口服后首先會在腸道菌群的作用下脫去糖基，生成相應苷元，如京尼平或梔子酸苷元。在體外，用杏仁β-D-葡萄糖苷酶在37℃、NH4Cl 存在條件下分別與梔子苷、羥異京尼平苷溫孵培養，檢測出京尼平和京尼平堿[15]，說明梔子苷和羥異京尼平苷還可以在腸道內發生N-雜環化反應，由氮取代2 位的氧，生成含氮化合物[18]。

1.2 在肝臟等部位的代謝

體內研究表明，梔子成分中吸收入血的苷元會在肝臟等部位發生廣泛的Ⅱ相反應，生成葡萄糖醛酸結合物、硫酸結合物等；之后，還會發生去羥基化、開環等反應，生成相應的代謝產物。有的苷元會再次轉化成苷，通過膽汁分泌到腸道，形成肝腸循環[19]。

Han 等[20]采用超高效液相色譜-電噴霧四極飛行時間串聯質譜法鑒定大鼠尿液中梔子苷代謝物。結果表明，梔子苷經腸道菌群去糖基后形成京尼平，被吸收進入血液；隨后發生京尼平的葡萄糖醛酸化和吡喃環開環裂解后的去羥基化、N-雜環化、還原反應及半胱氨酸結合反應。Li 等[21]分析大鼠灌胃給予梔子苷后血液、尿液、肝臟、腎臟等部位共33 種代謝產物，發現梔子苷發生了水解、羥基化、牛磺酸結合、氫化、脫羧、去甲基化、硫酸結合、半胱氨酸結合、葡萄糖醛酸結合等一系列反應及其復合反應。本課題組前期系統地研究了梔子在小鼠體內的代謝，從小鼠膽汁、血漿、尿液和糞便中鑒定出31 種原形化合物和38 種代謝物，提出了這些代謝物在體內的生物轉化途徑，包括Ⅰ相反應（水解、氫化、氧化、失氧、成酮、脫羧）和Ⅱ相反應（甘氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、谷氨酰胺、硫酸鹽結合和葡萄糖醛酸化）[22]。

Wang 等[23]分析人口服梔子后血漿和尿液中的梔子成分和代謝產物，其中，梔子酸、京尼平-O-葡萄糖醛酸去甲基化衍生物和單羥基京尼平-O-葡萄糖醛酸脫水產物只在人尿液中發現。推測梔子苷和梔子酸在人體內先水解成苷元后經歷葡萄糖醛酸化、羥基化或吡喃環開環、裂解等代謝過程排出體外，與大鼠體內代謝不同的是，在人體內存在一條不同的羥基化途徑。另外，有研究表明，京尼平對CYP3A4 和CYP2C19 的mRNA 和蛋白表達均有明顯的抑制作用[24]，提示在人體內可能發生京尼平與CYP3A4、CYP2C19底物的藥物間相互作用。

許多研究通過檢測并鑒定大鼠各個部位代謝物的結構以推斷潛在的代謝途徑，Wang 等[25]給大鼠灌胃梔子苷100 mg·kg－1后檢測各組織的AUC0→4h，結果腎＞脾＞肝＞心＞肺＞腦，這表明梔子苷在腎臟分布較多，但尚未有文獻系統地研究各個部位各代謝物的濃度。雖然諸多研究已經認定葡萄糖醛酸化和硫酸化是京尼平的主要代謝途徑[26-27]，但目前尚未有關于葡萄糖醛酸轉移酶和硫酸轉移酶各亞型在京尼平代謝過程中的貢獻的報道，且在肝臟內代謝的各酶促反應動力學過程等參數（如Vmax和Km）也未有闡述，這些都需要進一步的研究。

對于梔子中其他有效成分，王春雪等[28]發現了梔子酸在大鼠體內經脫水、開環、雙鍵還原和半胱氨酸結合等生物轉化產生了9 個代謝產物，綠原酸經脫羧、水解、甲基化、乙酰化、半胱氨酰甘氨酸結合和谷胱甘肽結合等生物轉化產生了12 個代謝產物。Jiang 等[17]分別取大鼠口服京尼平龍膽雙糖苷后的尿液、血漿、糞便及各臟器，發現京尼平龍膽雙糖苷口服后會發生去糖基化、羥基化、硫酸結合、9-葡萄糖醛酸化、氫化、脫甲基、糖基化和脫水共8 種生物轉化。

2 梔子主要有效成分的毒性及其機制研究進展

梔子的毒性反應類型以肝臟、胃腸道、腎臟損傷為主，但其毒性特征與機制不盡相同，本節主要對實驗動物水平的梔子毒性反應研究進行總結。

2.1 動物實驗水平胃腸道毒性特征與機制

大量研究顯示，苦寒中藥可以通過影響腸道菌群的動態平衡從而影響腸道的正常生物學功能[29]，梔子的腸毒性可能與此有關。俞琦等[30]以大鼠為實驗對象，以抗生素組和正常組作為對照，分別灌胃給予不同劑量的梔子水提物，結果表明，中、高劑量梔子水提物可引起大鼠腹瀉、體重減輕、被毛凌亂無光澤；但其對大鼠腸道的作用僅限于調節腸道菌群，并不導致腸道菌群明顯失調；同時對TNF-α、IL-6 等細胞因子的釋放有一定抑制作用，但機制尚未明確。陳麗艷等[31]研究了6 種具有代表性的人腸道菌群與梔子豉湯、梔子及淡豆豉的相互作用，體外實驗證明梔子可明顯抑制個別敏感腸菌，而梔子豉湯則可使菌群保持平衡，提示梔子與其他中藥的合理配伍或許可以降低腸道毒性，但仍有待進一步研究。上述研究結果的不一致性可能是由于大鼠與人的腸道菌群存在差異，且腸道菌群組成復雜，在不同個體中的種類、數量、比例各不相同，而研究中選擇測定的僅是目前認為具有代表性的一小部分，尚不全面，仍需進一步的探究。

既往對梔子毒性機制的研究多集中于其肝臟毒性，且以氧化應激和線粒體損傷的報道最為多見，內質網應激反應通路和炎癥應激反應通路未見報道。本課題組利用代謝組學的方法研究表明[32]，梔子提取物在大鼠體內的胃腸道毒性與其擾亂維生素B6、苯丙氨酸、花生四烯酸、牛磺酸和亞牛磺酸等內源性物質代謝密切相關，這提示梔子胃腸道毒性與炎癥應激反應通路有潛在關聯性，而持續的嚴重內質網應激會促進炎癥反應，誘發細胞凋亡。

2.2 動物實驗水平肝毒性特征與機制

梔子在臨床上主要用于肝臟疾病的治療，因此對其肝臟毒性的關注和相關研究也較多。

關于梔子肝臟毒性的物質基礎，有學者認為是梔子中的主要藥理成分梔子苷，也有人認為是其經腸道菌群水解產生的京尼平。任燕青等[33]以HepG2 肝細胞為研究對象，比較了梔子苷和京尼平的細胞毒作用，明確了京尼平為梔子肝細胞毒性物質。除京尼平外，還有研究認為京尼平在體內蓄積時會耗竭體內的谷胱甘肽，且能與體內其他氨基酸結合生成絡合物梔子藍，梔子藍是導致梔子肝臟毒性的關鍵性物質。衛璐戈等[34]通過動物及細胞毒性實驗，比較了梔子苷、京尼平和梔子藍的體內外肝毒性，結果與任燕青等[33]的研究結果相一致，進一步證明了京尼平是梔子肝臟毒性的主要物質基礎，其可能機制為京尼平與氨基酸結合生成絡合物，其生成過程本身消耗了體內的某些活性氨基酸；同時，研究結果表明極性大的梔子藍對肝臟的毒性很小，相對安全。

梔子苷經腸道菌群代謝生成的京尼平是目前較為公認的梔子肝毒性原因，對梔子毒性機制的研究也主要基于京尼平開展。京尼平引起的肝損傷發病機制復雜，尚未完全闡釋清楚，就目前研究現狀來說，主要包括以下幾點：① 直接損傷肝蛋白；② 氧化應激-線粒體損傷誘發細胞凋亡/壞死；③ 直接損傷線粒體；④ 破壞膽汁酸穩態。

2.2.1 直接損傷肝蛋白 Li 等[35]研究發現，京尼平在大鼠腸道菌群的作用下能進一步生成反應性的雙醛化合物中間體。該中間體可對肝蛋白賴氨酸殘基進行共價修飾，從而誘導大鼠產生肝毒性。

2.2.2 氧化應激-線粒體損傷誘發細胞凋亡/壞死 氧化應激是多種中草藥引起肝損傷的重要機制，是指活性氧的產生與體內抗氧化系統之間的失衡。就目前研究來看，梔子導致肝損傷的具體機制主要與氧化應激有關。Ding 等[36]對梔子苷在大鼠體內的急性毒性進行研究，發現其肝臟毒性機制主要與氧化應激、肝丙二醛濃度增加、總超氧化物歧化酶活性降低有關。任燕青等[33]也發現京尼平可顯著降低HepG2 肝細胞內抗氧化的能力，導致超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性下降以及谷胱甘肽含量降低，基于高內涵細胞成像分析技術（HCS）體外毒性評價研究發現，線粒體是活性氧的主要靶細胞器，活性氧誘發氧化應激所導致的線粒體損傷進而觸發級聯反應導致的細胞凋亡是京尼平肝毒性的主要機制之一。

2.2.3 直接損傷線粒體 Yang 等[37]研究表明，京尼平導致肝毒性的關鍵基團是1 位的羥基，它可以直接與線粒體UCP2 蛋白作用，抑制其功能，且能導致活性氧的產生，加重線粒體損傷。

2.2.4 破壞膽汁酸穩態 田婧卓[38]通過梔子苷在大鼠體內的急性毒性及長期毒性研究發現，梔子苷誘導的肝損傷作用與其誘導膽汁酸代謝紊亂、影響膽汁酸的合成與轉運有關。周飛等[39]結合臨床生化和組織病理學鑒別診斷，對梔子苷類藥物引起的SD 大鼠肝腎中膽紅素沉著進行了準確診斷，病理學檢查顯示，與對照組大鼠相比，給藥組大鼠血清總膽紅素（TB），g-谷氨酰轉移酶（GGT）濃度顯著性升高。并且，給藥組大鼠尿液中尿膽素原（URO）和尿液膽紅素（BIL）含量呈劑量相關性增加，對照組大鼠尿液中的 BIL 為陰性；肝腎組織HE 染色結果顯示，給藥組所有大鼠的肝臟和腎臟中出現極細微的棕黃色色素顆粒，且僅在顯微鏡×400 及以上倍數可辨認。這些色素顆粒主要分布于膽管周圍肝細胞的胞漿、腎小管上皮細胞中。特殊染色結果顯示，肝臟和腎臟出現的色素顆粒對于膽紅素染色（Fouchet 染色）呈清晰的陽性（綠色顆粒），而對于三價鐵/含鐵血黃素染色（Perls blue 染色）呈陰性。綜合藥物背景及給藥組大鼠血清中TB、GGT 以及尿液中URO、BIL 的升高，提示肝臟和腎臟中出現的棕黃色色素可能是膽紅素，再結合特殊染色對膽紅素染色呈清晰陽性的結果，最終確診為受試物——新型梔子苷類藥物引起SD 大鼠肝臟和腎臟的膽紅素沉著。這一研究結論也佐證了田婧卓[38]的觀點。

上述毒性機制（歸納于圖2，其相關指標歸納于表2）往往不會單獨作用，而是相互影響，互為因果，但具體機制的研究尚不完善，仍需進一步闡明。

圖2 梔子主要有效成分的代謝和肝臟毒性機制示意圖Fig 2 Metabolism and hepatotoxicity mechanism of main active components of Fructus Gardeniae

表2 梔子肝毒性機制相關指標總結Tab 2 Hepatotoxicity index of Fructus Gardeniae

此外，免疫反應也是藥物性肝損傷的常見機制之一。例如，近年來研究發現，何首烏的肝毒性就與免疫相關遺傳因素的差異有關[40]。據此，梔子誘發的肝損傷也可能與其活性代謝物如京尼平雙醛化合物等與肝蛋白的加合物被機體識別為抗原從而激發自身免疫反應有關，值得進一步的研究。

2.3 動物實驗水平腎毒性特征

長久以來，梔子作為藥食兩用的中藥材被廣泛使用，少見其毒性報道，但在動物實驗中可以觀察到梔子苷的腎臟毒性。程生輝等[13]在一項研究中考察了梔子苷對正常大鼠急性腎毒性的時-毒關系，發現給予正常大鼠一次性大劑量（1.2 g·kg－1）梔子苷后，其尿素氮、肌酐升高，表明存在一定的腎臟毒性，且造成的急性腎損傷可逆，并呈現一定的時-毒關系。馮筱懿等[41]研究表明，梔子苷高劑量（300 mg·kg－1）給藥3 d 可引起腎小管細胞輕度腫脹，呈現空泡樣變性，腎小球基本正常，大鼠的尿液中腎臟損傷因子（KIM-1）水平顯著增高，其中部分大鼠中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）水平也增高，但尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）尚未產生明顯變化；從高劑量組大鼠個體數據來看，尿液KIM-1 水平顯著升高（P＜0.01），NGAL 部分升高，且NGAL 明顯增高的大鼠KIM-1 水平也明顯增高，腎臟病理檢查顯示有病理損傷，說明兩者有一定相關性。這提示，在梔子臨床應用中除了目前常用的檢測腎功能的指標 BUN和 Cre 以外，尚需增加新的更為敏感的指標用于監測腎臟毒性，如KIM-1、NGAL。

由于梔子苷臨床常用于黃疸的治療，而藥物在正常個體與疾病狀態下機體中的代謝過程往往存在一定差異，近年來，梔子在黃疸動物模型中的毒性作用逐漸受到研究者的關注。程生輝等[42]研究表明，單次大劑量給予梔子苷對正常大鼠與黃疸大鼠均有腎毒性，都能引起BUN 和Cre 升高，且梔子苷在黃疸模型大鼠體內的最低中毒劑量明顯低于正常大鼠，說明在肝損傷狀態下，梔子苷更容易導致腎損傷。推測其形成原因可能與黃疸狀態下肝臟代謝能力下降影響了梔子苷在體內的代謝解毒有關。這提示在實際臨床中，黃疸患者即使使用治療劑量的梔子仍可能導致腎損傷，應注意梔子的臨床用量，且有必要進行梔子在疾病模型中的毒性及其機制相關研究。

3 臨床水平毒性特征

關于梔子的臨床毒性，特別是胃腸道損傷，古籍即有記載。如明代《醫宗必讀》指出梔子“大苦大寒，能損胃伐氣，虛者忌之”；《本草經疏》中明言：“梔子稟至苦大寒之氣，苦寒損胃而傷血，凡脾胃虛弱者忌之，血虛發熱者忌之。”說明長久以來，我國就已經有關于梔子胃腸道損傷、肝腎毒性的認識。而根據傳統中醫學理論，心與肝經絡相連，梔子歸心、肺、三焦經，而肺與大腸相表里，腎與三焦相通，為梔子毒性提供了理論基礎。

近年來也有一些關于梔子及其復方制劑毒性的文獻或報道。2015年版《中國藥典》規定梔子的用量為6～10 g，超量使用可能會導致嚴重不良反應。2017年，原國家食品藥品監督管理總局明確說明服用茵梔黃口服制劑（主要成分為梔子、茵陳、黃芩苷）會引起腹瀉、嘔吐等不良反應。黎冬梅[43]評價茵梔黃口服液治療足月新生兒黃疸的臨床療效和不良反應，發現觀察組不良反應發生率為13.3%，主要為腹瀉、嘔吐、不耐受，對照組不良反應發生率為0.0%，差異有統計學意義（P＜0.05），所以建議胃腸道功能障礙的患兒謹慎使用。賀學成等[44]提出，服用梔子金花丸（主要成分為梔子、黃芩、大黃等）、瀉下劑易致腹瀉、腹痛。余舒樂等[45]提取2017年江蘇省藥品不良反應監測系統中符合納入標準的熱毒寧注射液（主要成分為青蒿、金銀花、梔子）不良反應報告共1452 例，分析后得出不良反應大多輕微，主要累及皮膚如皮疹、面部潮紅等，其次為消化系統，表現為惡心嘔吐、腹脹腹痛、腹瀉。結合古籍記載及中醫學理論，可以推斷報道中梔子復方制劑關于胃腸道反應、肝腎功能毒性反應的相關記載很大程度上或與梔子有關。

4 結語

本文介紹了以梔子苷為代表的梔子主要有效成分的代謝及其在不同組織、器官中的代謝依賴性毒性特征及機制。但是，目前對于梔子的代謝過程及代謝依賴性毒性的研究仍有許多疑問：如梔子的毒性代謝產物京尼平的生成和消除（尤其是Ⅱ相代謝消除）過程尚未闡明，其中參與京尼平消除的酶的具體亞型（UGT 和SULT，以及可能的GST 亞型）及其在消除中的貢獻尚不明確，這些酶表達水平的變化是否可以調控京尼平的毒性等均尚未見報道。此外，不同個體對于梔子的毒性反應也大不相同。在對傳統中藥何首烏的研究中，Li 等[40]揭示了不同人對于何首烏所致的肝損傷的敏感性不同是由于其HLA-B*35：01等位基因存在差異性。這提示梔子毒性的個體差異或許也與等位基因的不同有關。今后的研究宜在前期工作的基礎上，從梔子的代謝途徑、代謝酶的表征、梔子的毒性機制及毒性相關基因的研究等方面入手，獲取更多、更深入的研究數據，以期為臨床合理用藥提供指導，為中藥成分的毒性研究提供新的思路與方法。