柴胡不同極性部位的體外抗氧化活性研究

黃小鳳，劉澤干，雷攀，王莉博，王淑惠，杜士明，*（.湖北醫(yī)藥學院藥學院，湖北 十堰44000；.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 44000；3.武當特色中藥研究湖北省重點實驗室·湖北醫(yī)藥學院，湖北十堰 44000）

自由基是人體內(nèi)各種生化反應的中間代謝產(chǎn)物，其異常累積使得機體發(fā)生氧化損傷，進而引發(fā)疾病，如肝癌、肝纖維化、阿爾茨海默癥、糖尿病及心血管等疾病[1]，Abenavoli 等[2]在改善非酒精性脂肪肝患者飲食習慣的研究中發(fā)現(xiàn)，與正常飲食組相比，抗氧化劑（Bilirel 復合物）的使用能有效改善患者肝臟脂肪堆積水平和肝硬化程度，表明抗氧化治療與疾病的發(fā)展進程密切相關(guān)。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，人參、姜黃、黃芪、鐵皮石斛、丹參等[3-7]中藥及其提取物均可通過清除自由基、調(diào)節(jié)氧化應激反應相關(guān)的信號通道（Nrf2/HO-1、AMPK/AKT 等）、降低脂質(zhì)過氧化水平等方式發(fā)揮抗氧化應激的作用。

《中國藥典》2020年版收載的柴胡（Bupleuri Radix）為傘形科植物柴胡Bupleuri RadixChineseDC.或狹葉柴胡Bupleuri RadixscorzonerifoliumWilld.的干燥根[8]，為常用解表藥，具有和解表里、疏肝升陽的功效，臨床主要用于感冒發(fā)熱、寒熱往來、肝郁氣滯等癥狀。現(xiàn)代藥理研究表明，柴胡具有抗氧化、抗炎保肝、抗菌和抗腫瘤等藥理作用[9-10]。任鵬等[11-13]研究以柴胡為君藥的方劑（柴胡疏肝散、小柴胡湯、柴胡愈肝湯）的體外自由基清除能力及抗氧化保肝作用時發(fā)現(xiàn)，各方劑均顯示出較好的自由基清除能力及較強的抗氧化能力，可進一步發(fā)揮保肝作用；研究表明，柴胡黃酮類、皂苷類、多糖類及揮發(fā)油類為柴胡發(fā)揮藥理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)群，可通過清除自由基、提高抗氧化酶活性等途徑發(fā)揮一定的抗氧化作用，進而發(fā)揮疾病預防或治療作用[14-17]，以上研究均提示中藥柴胡具有一定的抗氧化作用。目前，關(guān)于柴胡發(fā)揮抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究未見相關(guān)報道，本實驗通過測定柴胡5 種極性部位對羥自由基、DPPH 自由基、ABTS 自由基的清除能力和鐵還原能力，評價柴胡的抗氧化作用，明確作用物質(zhì)基礎(chǔ)，為柴胡藥材合理開發(fā)利用和臨床使用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

KWY-102 型電熱干燥箱（武漢市武昌實驗儀器廠）；LC-12N-50A 型冷凍干燥機（湖南力辰儀器科技有限公司）；FA-2004 型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；TDL-5A 型臺式離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TU-1901型紫外分光光度儀（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 試藥

柴胡飲片購自湖北神農(nóng)本草中藥飲片有限公司，經(jīng)十堰市太和醫(yī)院杜士明教授鑒定為傘形科柴胡屬植物北柴胡（Bupleuri RadixChineseDC.）的干燥根；維生素C（海口市制藥廠有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、過硫酸鉀、三氯乙酸（武漢安格思生物科技有限公司）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（中南化工試劑有限公司）；三氯化鐵（仙桃市化學試劑二廠）；鐵氰化鉀（天津市凱通化學試劑有限公司）；硫酸亞鐵（天津博迪化工股份有限公司）；過氧化氫（江西草珊瑚消毒用品有限公司）；水楊酸（中國醫(yī)藥公司）；乙醇及其余試劑均為分析純（武漢市中天化工有限責任公司）。

2 方法

2.1 柴胡不同極性部位的制備

2.1.1 柴胡水部位的制備[18]取柴胡飲片100 g，按料液比1∶8（g/mL）進行回流提取，先加入純化水500 mL，回流提取1.5 h，過濾，濾渣再加入300 mL 純化水提取1 h，合并濾液，減壓濃縮至100 mL，冷凍干燥濃縮液得柴胡水部位干燥品11.36 g。

2.1.2 柴胡乙醇部位的制備[19]取柴胡飲片100 g，按料液比1∶8（g/mL）進行回流提取，首先加入70%的乙醇500 mL，回流提取1 h，過濾，濾渣再加入70%的乙醇300 mL 提取0.5 h，合并濾液，減壓濃縮至140 mL，冷凍干燥濃縮液得柴胡乙醇部位干燥品14.01 g。

2.1.3 柴胡石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的制備[19]按“2.1.2”項下方法制備乙醇提取濃縮液140 mL，依次用等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑、低溫冷凍干燥后制得柴胡石油醚部位（1.48 g）、乙酸乙酯部位（1.74 g）和正丁醇部位（1.86 g）的干燥品。

2.2 體外抗氧化活性測定

2.2.1 水楊酸法測定羥自由基清除能力[20]取柴胡不同極性部位干燥品適量，以水或甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL－1的供試品溶液，以水配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg·mL－1的陽性藥物維生素C 溶液。分別取各供試品溶液及陽性藥物2 mL，依次加入FeSO4試液（9 mmol·L－1）和過氧化氫試液（8.8 mmol·L－1）各2 mL，搖勻后，再加入水楊酸乙醇試液（9 mmol·L－1）2 mL，混勻，置于37 ℃恒溫水浴中15 min，即得測定液；取適量測定液，3000 r·min－1離心10 min，取上清液，采用紫外可見光分光度儀于510 nm 處測定吸光度。

供試品溶液吸光度為Ai，以純化水為空白對照，吸光度為A0，混合試液為本底對照，吸光度為Aj。根據(jù)公式（1）計算出不同質(zhì)量濃度樣品溶液對羥自由基的清除率并通過SPSS 統(tǒng)計分析得到半清除率濃度（IC50）。

2.2.2 DPPH 法測定DPPH 自由基清除能力[21]分別取柴胡不同極性部位干燥品適量，以水或甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL－1的供試品溶液，以水配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg·mL－1的維生素C 溶液。分別取各供試品溶液2 mL 于10 mL 試管中，加入DPPH 乙醇溶液（0.1 mmol·L－1）2 mL，搖勻，室溫避光30 min，于517 nm 處測定吸光度。

供試品溶液吸光度為Ai，以純化水作為空白對照組，吸光度為A0，以無水乙醇代替DPPH 乙醇溶液作為本底組，吸光度為Aj。根據(jù)公式（2）計算出不同質(zhì)量濃度樣品溶液對DPPH 自由基的清除率并通過SPSS 統(tǒng)計分析得到IC50。

2.2.3 ABTS 法測定ABTS 自由基清除能力[22]取柴胡不同極性部位干燥品適量，以水或甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg·mL－1的供試品溶液，以水配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg·mL－1的維生素C溶液。將ABTS 溶液（7.4 mmol·L－1）和過硫酸鉀溶液（2.6 mmol·L－1）等體積混合，室溫避光放置12 h 后，得ABTS 母液，母液用純化水稀釋45 倍作為ABTS 自由基工作液。精密量取ABTS 自由基工作液2 mL 及各供試品溶液1 mL，充分搖勻，室溫避光30 min 后，于734 nm 處測定吸光度。

供試品溶液吸光度為Ai，以純化水作為空白對照組，吸光度為A0。根據(jù)公式（3）計算出不同質(zhì)量濃度樣品溶液對ABTS 自由基的清除率并通過SPSS 統(tǒng)計分析得到IC50。

2.2.4 普魯士藍法測定鐵還原能力[23]取柴胡不同極性部位干燥品適量，以水或甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL－1的供試品溶液，以水配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg·mL－1的維生素C 溶液。分別精密吸取2.5 mL 各供試品溶液于10 mL 試管中，加入磷酸鹽緩沖液（pH ＝6.6，0.2 mmol·L－1）及1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，充分搖勻，于50℃水浴20 min，取出迅速冷卻，再分別加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，充分搖勻后，3000 r·min－1離心10 min，分別吸取上清液2.5 mL 加入0.1%FeCl3溶液0.5 mL 及純化水1 mL，充分搖勻，室溫靜置10 min，于700 nm 處測定吸光度。

供試品溶液吸光度為Ai，以純化水為空白對照組，吸光度為A0。根據(jù)公式（4）計算不同濃度樣品溶液的鐵還原能力并通過SPSS 統(tǒng)計分析得到半數(shù)還原能力（A0.5）。

3 結(jié)果

3.1 柴胡不同極性部位提取物對羥自由基的清除能力

結(jié)果顯示柴胡5 種極性部位均具有較好的自由基清除能力，并且存在明顯的量效關(guān)系。水部位、乙醇部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位的IC50分別為0.685、0.835、2.130、0.177、0.985 mg·mL－1，清除羥自由基的能力順序為：乙酸乙酯部位＞水部位＞乙醇部位＞正丁醇部位＞石油醚部位，詳見表1和圖1。

表1 柴胡各極性部位提取物對羥自由基的清除能力Tab 1 Hydroxy radical scavenging abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

圖1 柴胡各極性部位提取物對羥自由基的清除能力Fig 1 Hydroxy radical scavenging abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

3.2 柴胡不同極性部位提取物對DPPH 自由基的清除能力

柴胡不同極性部位均表現(xiàn)出一定的DPPH 自由基清除能力，且與質(zhì)量濃度成正相關(guān)。其中乙酸乙酯部位對DPPH 自由基的清除能力最強，IC50＝0.171 mg·mL－1，當乙酸乙酯部位濃度為0.8 mg·mL－1時，DPPH 自由基清除能力達到90%。水部位、乙醇部位、正丁醇部位、石油醚部位對DPPH 自由基清除效果依次減弱，IC50分別為0.216、0.249、0.354 和0.422 mg·mL－1，結(jié)果見表2和圖2。

表2 柴胡各極性部位提取物對DPPH 自由基的清除能力Tab 2 DPPH radical scavenging abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

圖2 柴胡各極性部位提取物對DPPH 自由基的清除能力Fig 2 DPPH radical scavenging abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

3.3 柴胡不同極性部位提取物對ABTS 自由基的清除能力

結(jié)果顯示各部位對ABTS 自由基的清除能力隨著提取物的質(zhì)量濃度增大而逐漸增強，但均弱于維生素C。乙酸乙酯部位清除能力最強，其IC50為0.095 mg·mL－1，其次為正丁醇部位，IC50為0.130 mg·mL－1，水部位和乙醇部位對ABTS 自由基的清除能力相近，IC50均為0.156 mg·mL－1，石油醚部位活性最差I(lǐng)C50為0.265 mg·mL－1，結(jié)果見表3和圖3。

表3 柴胡各極性部位提取物對ABTS 自由基的清除能力Tab 3 ABTS radical scavenging abilities of diferent polar extracts of Bupleurum

圖3 柴胡各極性部位提取物對ABTS 自由基的清除能力Fig 3 ABTS radical scavenging abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

3.4 柴胡不同極性部位提取物的鐵還原能力

通過普魯士藍法檢測鐵還原能力，結(jié)果水部位、乙醇部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的A0.5分別為1.053、1.079、1.432、0.491、1.415 mg·mL－1，乙酸乙酯部位鐵還原能力最強，但弱于維生素C，各部位提取物均顯示出一定的量效關(guān)系，與質(zhì)量濃度成正相關(guān)。柴胡各部位的鐵還原能力大小順序為：乙酸乙酯部位＞水部位≈乙醇部位＞正丁醇部位＞石油醚部位，結(jié)果見表4和圖4。

表4 柴胡各極性部位提取物的鐵還原能力Tab 4 Iron reduction abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

圖4 柴胡各極性部位提取物對鐵的還原能力Fig 4 Reduction abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

4 討論

本實驗采用水楊酸法、DPPH 法、ABTS 法和普魯士藍法對柴胡5 種極性部位的體外抗氧化能力進行了評價和比較，結(jié)果顯示各部位提取物均有較好的體外抗氧化能力；同時，研究發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位的羥自由基、DPPH 自由基和ABTS 自由基清除能力，以及鐵還原能力均強于其他部位，當質(zhì)量濃度達到0.2 mg·mL－1時，清除率均在50%以上，其次是柴胡水部位及乙醇部位，正丁醇部位和石油醚部位逐漸減弱，說明柴胡的不同極性提取部位的抗氧化能力存在差異，其原因可能與5 種極性部位中柴胡主要活性成分的種類及其含量不同有關(guān)，柴胡中主要活性成分為柴胡皂苷、柴胡黃酮和柴胡多糖，研究表明，大多皂苷類、黃酮類、多糖類成分具有顯著的抗氧化活性[24-26]。Chen 等[27]通過香煙煙霧誘導建立小鼠肺損傷模型，實驗組給予柴胡皂苷a 干預，結(jié)果顯示柴胡皂苷a 可通過激活Nrf2 信號通路，促進血紅素加氧酶1（HO-1）的表達，降低髓過氧化酶（MPO）及丙二醛（MDA）水平，發(fā)揮抗氧化作用，進而阻斷或延緩疾病的進展；杜柯等[28]通過體外化學方法測定柴胡多糖的抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，柴胡多糖可有效清除羥自由基；以上研究提示，柴胡5 種極性部位抗氧化能力的不同，可能與柴胡皂苷、柴胡黃酮及柴胡多糖的含量有關(guān)。

本實驗主要通過體外化學方法考察柴胡5 種不同極性部位的抗氧化能力，其體內(nèi)抗氧化作用還有待進一步明確，課題組后續(xù)將通過提取分離柴胡物質(zhì)群并進行體內(nèi)抗氧化研究，進一步探討柴胡抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)、協(xié)同作用及其作用機制。綜上所述，本實驗通過檢測體外抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)柴胡各極性部位均具有較好的抗氧化能力，但各部位的抗氧化能力存在一定的差異，其中乙酸乙酯部位的抗氧化活性最強，可為深入研究柴胡活性化合物提供依據(jù)。