bcl-2、bax在膝關節骨性關節炎發生、發展中的作用

柯俊泉，董 忠 ，潘廷明，汪偉劍

（福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003）

膝關節骨性關節炎（KOA）是中老年人的常見病和多發病。有調查報告指出，60 歲以上的老年人KOA 的患病率為50%，75 歲以上的老年人KOA 的患病率為80%[1-2]。該病主要的臨床特點為關節軟骨組織退變、軟骨丟失、軟骨下骨改變及滑膜炎等關節組織病變。該病可導致患者出現患側膝關節腫痛、膝關節活動受限等，甚至可發生嚴重的關節畸形。隨著臨床上對KOA 病理機制研究的不斷深入，相關的研究人員越來越關注軟骨細胞凋亡與KOA 進展之間的關系[3]。軟骨組織中的細胞凋亡是一種由基因控制的細胞自主有序的死亡，屬于細胞的程序性死亡。軟骨細胞凋亡的發生機制非常復雜，但其凋亡過程具有獨特性。軟骨細胞的凋亡過程與基質降解具有緊密的關聯性[4-5]。當某些病理因素作用于軟骨細胞時，細胞凋亡機制可被啟動。細胞的過度凋亡可間接導致基質合成相應減少，軟骨細胞失去維持內環境穩定的功能，從而可形成惡性循環。bcl-2 基因是參與關節軟骨細胞凋亡的相關原癌基因之一。bcl-2 家族中有許多可促進軟骨細胞凋亡和抑制軟骨細胞凋亡的成員，包括bcl-2、bax 和bcl-x 等。軟骨細胞的大量凋亡與bcl-2和bax 失衡有關[6]。

1 bcl-2、bax 在軟骨細胞凋亡中的作用

bcl-2 家族主要是通過表達蛋白的相互作用來實現調控軟骨細胞凋亡的目的。軟骨細胞凋亡是指在一定的生理或病理因素影響下，軟骨細胞自主啟動死亡程序。而當局部軟骨組織發生損傷或有相關的凋亡因子介入，迫使大量的軟骨細胞不得不啟動凋亡程序時，細胞外基質的合成與降解可失衡，凋亡小體的數量可增多，從而可使軟骨細胞無法維持內環境的穩定。在bcl-2 家族中，bcl-2 和bax 是一組細胞凋亡調控基因。目前，醫學界對bcl-2 和bax 的結構和生理功能都有深度的研究。

軟骨細胞凋亡是一個有多種細胞因子、多種細胞信號轉導通路參與的復雜的病理過程。該過程主要涉及上游和下游信號通路。上游信號通路包括MAPKs、PI3K-Akt、JAKs/statl、Wnt/β-Catenin 和核因子kB。下游信號通路主要涵蓋死亡受體途徑，以及與bcl-2、bax 關系密切的線粒體途徑和內質網應激反應性凋亡途徑[7]。bcl-2 和bax 可通過表達的蛋白直接或間接參與到凋亡信號的轉導通路中，從而實現調節細胞凋亡的作用。bcl-2 可通過表達蛋白實現抗凋亡的作用，其表達的蛋白主要錨定于線粒體膜、內質網和核膜等。因此，bcl-2 蛋白可存在于內質網上，這種結構使其可阻斷Ca2+向細胞質的流動，間接促使Ca2+依賴性核酸內切酶失去活性，從而實現抑制細胞凋亡的目的。另外，bcl-2 蛋白還可改變線粒體巰基的氧化還原狀態，通過膜電位調節細胞的凋亡，并可通過抑制caspase 的激活及細胞色素c（cytc）、凋亡誘導因子（AIF）等重要蛋白的釋放，起到阻抑細胞凋亡的作用[8]。因此，bcl-2 蛋白結合相關因子常被用于評價bcl-2 家族基因在細胞凋亡中的作用。王振龍等[9]通過藥物干預的方式降低腫瘤細胞中bcl-2 的表達，增加其中bax 的表達，同時采用蛋白質印跡法（Western blot）檢測到腫瘤細胞中CHOP 的表達上調。CHOP 是內質網應激介導凋亡的重要促進因子。張鐵山等[10]通過進行氟誘導乳鼠軟骨細胞凋亡機制實驗發現，凋亡的軟骨細胞具有細胞核緊縮凝聚、內膜結構不清、內質網擴張的特點，并顯露大量的空泡，其中的bcl-2 蛋白表達也明顯降低。bax 表達的蛋白是一種整合膜蛋白，主要散落在細胞的內膜、細胞質和細胞核中，通過形成同型二聚體促進細胞的凋亡。bcl-2 蛋白可與bax 競爭性地結合，并形成更為穩定的bcl-2/bax 異二聚體。bcl-2/bax 二聚體可阻抑bax/bax 誘導的細胞凋亡。因此，bcl-2/bax 可構成一個平衡系統。在該系統中，bcl-2 蛋白占優勢時，細胞可生存，bax 蛋白大量表達則可加速細胞的凋亡[11]。二者的蛋白表達比值可控制細胞的生存與凋亡。

2 軟骨細胞凋亡對KOA 的影響

KOA 是由于機械和生物因素的長期累積作用，使軟骨細胞過度凋亡，細胞外基質的合成與代謝發生紊亂所導致的膝關節疾病[12]。軟骨細胞是成熟軟骨中唯一能維持內部環境平衡的細胞類型。這類細胞過度凋亡可加重KOA 的病情。因此，有研究認為，阻抑軟骨細胞的凋亡可在一定程度上改變KOA 的轉歸[13-14]。KOA 的發生和發展是一個漫長而緩慢的過程，這也與軟骨細胞的凋亡過程不同步有關。大量的實驗結果證實，在正常的膝關節軟骨組織中，凋亡細胞的檢出率很低，且多存在于軟骨表面。但在KOA 模型中，軟骨表面至中層都存在細胞凋亡的現象。當軟骨表面發生纖維化時，這種現象甚至可出現在軟骨深層。

近年來，關于軟骨細胞凋亡在KOA 中作用的研究越來越多。相關的動物實驗[15-16]、人體實驗（包含體外和體內實驗）[17]結果表明，在發生KOA 的軟骨組織中，細胞凋亡的發生率很高。軟骨細胞凋亡在KOA 的進展中具有重要的作用。目前，大多數的實驗研究均以動物KOA 模型為研究對象。末端脫氧核苷酸轉移酶介導的原位缺口末端標記測定法（TUNEL）是目前檢測軟骨細胞凋亡過程中染色體DNA 斷裂的常用方法。

3 預處理KOA 模型對bcl-2 和bax 蛋白表達的影響

軟骨細胞過度凋亡是KOA 發生發展過程中出現的一種病理變化過程。bcl-2 和bax 基因是參與軟骨細胞凋亡機制的一類相關因子。因此，通過影響bcl-2 和bax 的表達，阻抑軟骨細胞的凋亡，闡明預處理在KOA 治療中的有效性成為近年來臨床上研究的重點。具體而言，即運用各種檢測bcl-2 和bax 蛋白的手段、預處理方法可明顯減少KOA 患者軟骨組織中的凋亡細胞。而且，運用檢測bcl-2 和bax 蛋白的手段發現bcl-2 的表達增加、bax 的表達降低可在一定程度上闡釋預處理在KOA 治療中的有效性。

邢恩福等[18]將rhil-1 受體拮抗劑注入兔KOA 模型的膝關節腔內，并采用TUNEL 染色法在光鏡下觀察兔膝關節軟骨組織中細胞凋亡的情況，結果顯示，與模型組兔相比，實驗組兔軟骨組織中的凋亡細胞明顯減少。該研究結果表明，采用rhil-1 受體拮抗劑對兔KOA 模型進行預處理可降低其軟骨細胞的凋亡率。進行Western blot 檢測的結果表明，與模型組兔相比，實驗組兔軟骨組織中bcl-2 蛋白的表達明顯增加，bax 蛋白的表達顯著降低。進行逆轉錄- 聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測的結果顯示，實驗組兔軟骨組織中bcl-2 蛋白的信使核糖核酸（mRNA）增強，bax 蛋白的mRNA 減弱。近年來，張媛媛等[19]、張宇標等[20]、胡炯等[21]分別采用電針、甲基蓮心堿和染料木素對大鼠KOA 模型進行預處理后發現，與KOA 模型組大鼠相比，實驗組大鼠軟骨組織中凋亡阻抑蛋白bcl-2 的表達升高，促凋亡蛋白bax的表達降低。此外，中藥在減輕KOA 的嚴重程度中顯示出良好的作用。何曉瑾等[22]研究骨痹方對KOA 大鼠軟骨細胞結構和功能的影響后發現，該方可促進其軟骨組織中Akt和Bcl-2 蛋白的表達，抑制其軟骨細胞的凋亡。李成付等[23]對兔KOA 模型軟骨組織中bcl-2/bax、Akt 的表達進行研究后發現，牛膝乙醇提取物可有效增加兔軟骨組織中bcl-2 和bax 蛋白的表達，阻抑其軟骨細胞的凋亡。

4 軟骨細胞凋亡與軟骨細胞自噬的關系

軟骨細胞的死亡可能包括凋亡和自噬兩種形式。這兩種形式可能存在于KOA 的不同病理階段。但自噬與凋亡、壞死不同。在軟骨細胞發生自噬的早期，其中的染色質可發生無序凝聚，高爾基體和內質網的數量可增加，吞噬小泡和細胞外基質小泡可發生聚集。西班牙拉科魯納的研究人員曾表示，增加KOA 患者軟骨細胞的自噬水平可防止其軟骨組織發生退化[24]。一項關于TUNEL 染色陽性的人骨關節炎軟骨細胞的研究表明，高爾基58 K 蛋白和caspase-2l重疊，這一研究結果證實了上述的觀點[25]。相關的研究報道表明，bcl-2 可作用于陽性的自噬調節因子beclin-1[26]。這些證據都提示，細胞凋亡與細胞自噬之間存在一定的關聯性。這二者之間的關聯性也為研究KOA 與軟骨細胞凋亡關聯性的人員提供了新的研究思路。

5 小結

KOA 的發病機制非常復雜。臨床上尚不清楚該病具體的發病機制。目前，對bax 和bcl-2 的研究主要集中在動物實驗和細胞實驗上。bax 和bcl-2 是兩種已明確可參與細胞凋亡信號轉導途徑的相關因子，可能存在于軟骨細胞凋亡的多個信號途徑中。現今，關于軟骨細胞凋亡信號通路與KOA 發病關系的研究報道較少。今后，相關的研究人員可加強對bax 和bcl-2 蛋白的深入研究，并對各種途徑之間的聯系進行研究，從而為臨床上治療KOA 提供指導。