細胞自噬在輻射誘導旁效應中的作用研究進展

楊廷芳，王 麗，史月濱，陸 婷，張 勇

1昆明醫科大學，云南昆明 650500；2 昆明醫科大學第一附屬醫院，云南昆明 650032；3 云南省第一人民醫院，云南昆明 650032

放射治療在惡性腫瘤治療中占據重要地位。盡管放療技術的不斷革新使治療效果及患者生活質量明顯改善，但輻射誘導旁效應(the radiationinduced bystander effect，RIBE)也引起了科研及臨床工作者們的重視。截至目前，尚無確切方法防治輻射旁效應。輻射誘導旁效應已成為放射生物學及輻射防護領域的研究熱點，研究其調控機制對優化放射治療、放射防護及輻射安全等具有重要意義。

1 輻射誘導旁效應概述

輻射誘導旁效應指受輻射細胞或組織釋放的信號導致未受輻射的機體其他部位發生的生物學現象，包括基因組不穩定、應激反應、凋亡及細胞增殖改變等生物學反應[1-2]。

關于RIBE 的報道可追溯到1954 年，Parsons等[3]發現慢性粒細胞性白血病患者的脾經X 線照射后，胸骨骨髓中檢測到導致染色體結構損傷的因子——致裂因子。1992 年Nagasawa 和Little[4]發現當0.1%～1% 中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cells，CHO)受α 粒子照射時，30%～50%的細胞出現姐妹染色單體交換，表明射線誘發了輻射旁效應。此研究開啟了以細胞模型研究輻射誘導旁效應的先例，也引起了研究者們對輻射旁效應的高度重視。此后，研究者們在大多數細胞中觀察到了輻射誘導旁效應[5]。臨床研究也發現腫瘤放射治療后可引起正常組織的損傷，常見的有肺癌放療所致放射性肺炎和放射性肺纖維化[6]。

輻射旁效應是保護因素還是有害因素曾一度引發爭議。實驗證據已將RIBE 與癌癥的許多特征聯系起來，包括基因組不穩定、細胞能量失調、抵抗細胞死亡、腫瘤免疫逃避、腫瘤促進炎癥以及增強的放射抵抗，突出了RIBE 事件在患者治療中的不良反應作用[7]。但近期有研究又重新確立了RIBE 在放射治療中對轉移瘤的殺傷作用。Tubin等[8]回顧分析了23 例接受非傳統立體定向放射治療(stereotactic body radiation therapy，SBRT) 的不可切除的大體積腫瘤病例，對腫瘤的低氧節段(SBRT-PATHY)利用非靶向效應進行放射治療，發現RIBE 響應率為96%。放射治療4 周后，腫瘤體積縮小的中位值為70%，17%的研究對象完全緩解，且未出現任何急性或遲發毒性反應。表明SBRT-PATHY 在利用輻射缺氧誘導的非靶向效應在治療腫瘤方面起到了顯著作用。但受限于樣本量，缺乏前瞻性研究的證實。近年Farias 等[9]開發了新模型，使用人臍帶間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)和射線照射同時干預異體腫瘤移植小鼠模型，發現協同機制的存在。這種機制能夠增強輻射殺滅原發腫瘤及轉移灶的局部和全身性反應，表明了輻射誘導旁效應在殺滅腫瘤轉移灶中有其作用。有研究者建立外泌體聯合放射治療的模型，研究輻射誘導旁效應。De Araujo Farias等[10]發現人臍帶間充質干細胞產生的外泌體聯合放射治療，可抑制轉移性黑色素瘤細胞的擴散，表明外泌體聯合放射治療參與了輻射誘導旁效應，該研究將放射治療的局部治療作用拓展到全身療效上，開拓了轉移性腫瘤的治療思路。

2 輻射誘導旁效應機制研究

早期研究認為輻射旁效應的機制主要是通過細胞間縫隙連接(gap junction intercellular communication，GJIC)和活化生化信號分子兩條途徑傳遞信號[11-12]。近年來，越來越多的證據表明外泌體是介導輻射誘導旁效應機制的一條重要途徑[13-15]。

2.1GJIC 研究表明GJIC 是由連接蛋白Connexin形成的簇狀細胞管道結構，在相鄰細胞之間的信號傳遞和物質交換中起重要作用，而連接蛋白存在于人類所有類型的解剖組織中[16]。RIBE 可以通過GJIC 將輻照細胞釋放的損傷信號傳遞給未受射線照射的旁細胞，從而引起旁細胞的損傷改變。Autsavapromporn 等[11]發現細胞在質子和重離子照射時產生的信號通過細胞間縫隙連接可損傷旁細胞，這種損傷效應可以傳給其子代細胞，子代旁細胞的應激效應水平取決于線性能量傳遞(linear energy transfer，LET)的特性。GJIC 抑制劑可減輕高LET 射線(質子或碳離子)對旁細胞后代的氧化損傷和基因損傷，但不能減輕低LET 射線(X 射線)對旁細胞后代的損傷作用。此外，Arora 等[17]使用肺癌細胞系和卵巢癌細胞系研究順鉑通過GJIC 誘導旁細胞發生毒性損傷時，發現順鉑對旁細胞的損傷作用是由癌細胞密度決定的。只有在高密度縫隙連接結構形成，靶向抑制連接蛋白43(connexin43，Cx43)時，旁細胞不發生毒性損傷反應，從而表現為癌細胞對順鉑耐藥。表明GJIC 有增強順鉑對旁細胞毒性損傷的作用，且與連接蛋白的密度呈正相關關系。上述研究證實GJIC 是RIBE 的機制之一，GJIC 通過連接蛋白介導RIBE。

2.2活化生化信號分子及相關通路 研究發現腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGFβ)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、一氧化氮(NO)及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) 通路參與RIBE[18-20]。Widel 等[21]用X 線照射野生型和TP53 基因敲除的人結直腸癌細胞HCT116，然后與未受照射共培養，IL-6 和IL-8 參與RIBE。Sergeeva 等[19]發現ROS 和超氧化物自由基(superoxide radical production，NOX)參與RIBE。Fu 等[20]發現經α 粒子照射后，MAPK通路和NF-κ 通路協同作用調節巨噬細胞釋放TNF-α 和IL-8，在RIBE 中促進旁細胞損傷。Fu等[22]發現在受輻照細胞中，RIBE 分子機制依賴于p53 活化及相關凋亡通路，局部照射后輻射誘導旁效應及巨噬細胞介導的輻射誘導旁效應是局部照射后常見的淋巴細胞減少的原因之一。已知半胱氨酸蛋白酶CPR4(一種同源的人組織蛋白酶B)為線蟲的首個輻射誘導旁效應因子。Peng 等[1]發現受紫外線或γ 射線照射的秀麗隱桿線蟲分泌的CPR-4，降低了紫外線劑量依賴性動物的生殖細胞死亡率，也增加了未受輻射的動物胚胎死亡率，導致了輻射組織遠隔的未受照射組織損傷，他們推測CPR-4 是通過胰島素樣生長因子受體DAF-2 發揮輻射誘導旁效應作用，此研究為輻射誘導旁效應作用機制提供了新思路。上述研究通過體內外實驗，證實了活化生化信號分子及相關通路是RIBE 產生的重要信號傳遞途徑，深入研究活化生化信號分子及相關通路在RIBE 中的作用，可為揭示RIBE 的產生機制及其防治提供理論依據。

2.3外泌體 近年來，研究表明外泌體也參與輻射旁效應[23]。眾多研究已通過外泌體內含物，包括DNA、miRNA 及蛋白層面，研究外泌體在RIBE 中的作用。陳纖等[24]用X 線照射H460 非小細胞肺癌細胞，采用差速離心法提取外泌體處理旁細胞，發現旁細胞的微核形成率增加，這種現象在用RNA 酶處理外泌體后消失，受照射H460 細胞分泌的外泌體可能是介導電離輻射旁效應的機制之一，外泌體RNA 可能是介導電離輻射誘導旁效應的一種重要信號分子，并推測外泌體可能通過膜融合的方式進入旁細胞。Ariyoshi 等[13]用4 Gy X 線分別照射細胞條件培養基(irradiated cell conditioned medium，ICCM) 及小鼠血清，然后提取對應的外泌體樣囊泡(exosome-like，ELV)處理正常人成纖維細胞，發現處理后的細胞均出現DNA 損傷，進一步用DNA 酶、RNA 酶和蛋白酶處理從條件培養基中提取的外泌體囊泡(ICCM ELV)，證實輻射誘導旁效應是由外泌體樣囊泡中的線粒體DNA 介導的。外泌體來源的miRNA 亦被證實在RIBE 中起重要作用，包括在放射治療后激活輻射旁效應并引起基因組不穩定[15]。宋曼[25]用射線照射人支氣管上皮BEP2D 細胞，發現輻射誘導的外泌體miR-1246 通過條件培養基促進未照射細胞微核的產生和DNA 損傷相關蛋白53BP1 聚焦點(foci)的形成，產生旁基因組損傷效應，證實了外泌體miRNA 參與RIBE。Tan 等[26]采用兩種細胞系共培養的方法，首次發現分別與α 粒子、X 線照射的皮膚角質HaCaT 細胞共培養后，未受輻射的WS1 細胞遷移受到抑制，進而發現內含miR-27a 的外泌體是主要的RIBE 信號因子；再用含miR-27a 的外泌體處理未受輻射的WS1 細胞，發現升高的miR-27a 根據細胞內的氧化還原狀態通過MMP2 抑制旁效應細胞遷移，證實外泌體miRNA 是介導RIBE 的重要調節因子。此外，外泌體來源的蛋白質也參與RIBE。Freudenmann 等[14]發現癌細胞通過外泌體分泌的L-Plastin 蛋白促進癌細胞克隆形成和有絲分裂活性增加，腫瘤細胞經輻射后產生的生長抑制因子減少；進一步通過免疫沉淀及siRNA 敲低L-Plastin 蛋白表達后，推斷RIBE 是由輻射觸發的有絲分裂活性或克隆形成降低所致。Mo 等[27]分別于正常氧含量和缺氧條件下，照射非小細胞肺癌A549 細胞，然后提取外泌體與未受輻射的A549 細胞或人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)共培養，發現外泌體明顯促進了A549 細胞增殖、遷移和侵襲，促進HUVEC 增殖和血管新生。缺氧細胞和輻照細胞釋放的外泌體較正常細胞釋放的外泌體促進腫瘤進展的作用更強。發現外泌體內的血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4) 可促進A549 細胞遷移和HUVEC血管新生。近期Dong 等[28]發現內質網和線粒體等細胞器也參與RIBE，該研究是對外泌體等囊泡參與RIBE 機制研究的拓展。

3 細胞自噬與輻射誘導旁效應

3.1細胞自噬 細胞自噬，又稱Ⅱ型程序性細胞死亡，指細胞受刺激時利用溶酶體消化回收廢棄的細胞成分和細胞器以實現對自身代謝和能量的更新[29]。細胞自噬是真核細胞的一種自我保護機制，在維持細胞穩態、能量代謝及應對應激等方面起著重要的作用[30]。哺乳動物的細胞自噬分為三類：大自噬/小自噬和分子伴侶介導的自噬[31]。目前認為細胞自噬起到抑制腫瘤發生的作用，但在腫瘤發展的進程中起促進作用[32-33]。

3.2GJIC 參與RIBE 細胞自噬 范華東[34]采用體外質粒轉染實驗研究細胞自噬在α 粒子輻射旁效應中的作用，發現不同劑量α 粒子輻射細胞產生的不同水平ROS，在細胞間縫隙連接途徑誘導旁區細胞自噬中起關鍵作用。作為細胞間縫隙連接的關鍵組成分子及細胞自噬系統底物的Cx43，介導照射區細胞產生的ROS 向旁細胞傳遞[35]。低劑量(10 cGy)、高劑量(300 cGy)α 粒子輻照細胞產生ROS，一方面通過GJIC 分別引起旁細胞自噬的激活和抑制；另一方面ROS 分別激活和抑制酪氨酸激酶Src，引起旁細胞自噬的激活和抑制。此研究可為腫瘤放射治療保護非靶器官提供實驗依據。

研究表明ROS 是細胞氧化還原的下游調控靶點。Yang 等[36]在經α 粒子照射的肝癌細胞HepG2中發現活化的酪氨酸激酶Src 使Cx43 265 位點酪氨酸磷酸化，抑制輻照細胞的Cx43 磷酸化水平后，發現旁細胞中DNA 損傷蛋白γ-H2A 焦點形成率顯著增加；他們進一步證實了自噬調控Src 活性和Cx43 磷酸化，并且旁細胞自噬水平與輻射誘導的ROS 相關。此研究為ROS 和自噬通過調控Src-Cx43 通路介導GJIC 參與RIBE 自噬提供了依據。吳李君[37]用50 cGy α 粒子照射HepG2 細胞后，也證實了自噬途徑通過調節Src 激酶活性參與Cx43 的磷酸化，而Cx43 第265 位的磷酸化是影響RIBE 的重要途徑。上述兩項研究的結果與范華東的研究相符，證實α 粒子誘發的ROS 通過GJIC調控旁細胞自噬。

3.3活性生化信號分子參與RIBE 細胞自噬 電離輻射可通過釋放促進腫瘤進展的衰老相關分泌因子(senescence-associated secretory phenotypes，SASps)誘導未受照射的旁細胞產生有害的輻射誘導旁效應。Huang 等[38]發現細胞自噬是輻射誘導垂體瘤轉化基因1(pituitary tumor transforming gene1，PTTG1)缺陷的乳腺癌細胞發生衰老的必要條件，抑制自噬可使細胞由X 線輻射誘導的衰老狀態轉變為凋亡；衰老的癌細胞通過釋放CSF2 激活JAK2-STAT3 和AKT 通路，促進未受輻射細胞發生侵襲和遷移而發揮輻射誘導旁效應。此研究首次揭示了自噬在輻射誘導衰老和旁效應中的雙重作用。

Wang 等[39]采用3 Gy γ 射線照射人肝癌細胞HepG2，收集條件培養基(conditioned medium，CM)處理非輻射細胞，并檢測到伴隨細胞內ROS 增加的線粒體功能障礙(線粒體膜蛋白MMP)，微核和自噬蛋白標志物表達量升高；1% 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO) 加入到CM 后，旁細胞的微核數量及自噬蛋白標志物含量顯著降低，輻射旁細胞轉染自噬相關蛋白LC3 siRNA 或Beclin-1 siRNA 后，旁細胞的微核數量顯著增加。此研究證實了ROS 參與RIBE 細胞自噬。Kong 等[40]發現用X 線照射海拉細胞，未受照射的旁細胞(unirradiated cell，UIC)，特別是具有預誘導自噬的UIC，可以分泌IL-6，并且證實自噬可以激活自噬過程中產生IL-6 所需的信號轉導和轉錄激活因子3(the signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)。得出RIBE 的代謝協同作用很可能是由受輻照的細胞釋放的旁觀者因子啟動，誘導UIC發生自噬并激活STAT3 產生IL-6，最終表現為UIC 分泌的IL-6 激活UIC 中NF-κB 通路的結論。

3.4外泌體參與RIBE 細胞自噬 外泌體作為一條額外的通路在RIBE 細胞間通訊中起著重要作用[15]。Song 等[41]用2 Gy γ 射線照射人支氣管上皮BEP2D 細胞，發現外泌體中的microRNA-7-5p 可通過EGFR/Akt/mTOR 信號通路介導輻射旁細胞發生自噬，這種外泌體介導的自噬可以被microRNA-7-5p 抑制劑抑制，證實外泌體參與RIBE細胞自噬。Cai 等[42]經10 Gy X 線照射小鼠大腦后，從星形膠質細胞中提取外泌體并染色，然后分別加入未照射星形膠質細胞及經尾靜脈注射到自噬雙標LC3B-GFP 小鼠體內，檢測到未受照射的細胞及小鼠肺組織中microRNA-7 水平升高而凋亡蛋白Bcl-2 水平降低，接著用雙熒光素酶報告基因檢測證實microRNA-7 直接靶向Bcl-2，證實了外泌體microRNA-7 靶向Bcl-2 介導局灶性腦照射后肺內旁觀者自噬。該研究從體內和體外實驗證實了外泌體介導輻射旁自噬。

4 問題與展望

目前RIBE 的機制研究主要集中于細胞間縫隙連接、活性生化信號分子及外泌體三條途徑。近年來研究發現細胞自噬存在于RIBE 中，是旁效應細胞的一種反應，但對于其在RIBE 中作用的研究很少。目前常用的自噬檢測方法，如電鏡觀察自噬體和溶酶體的超微結構、生化檢測自噬體膜標志蛋白及自噬底物、免疫熒光檢測自噬相關蛋白LC3 或GFP-LC3 斑點形成等，特異性及準確性欠佳，增加了對自噬的功能評估難度，也限制了其研究進展。Tian 等[43]開發了一種有效檢測哺乳動物自噬的單克隆抗體，今后會有更多高效準確的自噬檢測方法出現。近年來，外泌體在RIBE 中的研究越來越多，涉及外泌體miRNA、線粒體DNA 及蛋白質等層面。已有研究發現外泌體介導旁區細胞自噬。進一步研究細胞的自噬系統及外泌體如何協同作用參與旁細胞自噬，將有助于揭示RIBE 的機制。此外，當輻射劑量超過一定閾值時，輻射誘導旁效應不再增加，這是否與分布在細胞膜上的細胞間縫隙連接的組成分子的數量和密度有關?不同劑量率對自噬在輻射旁效應的影響及時間-效應機制也尚不清楚。同時，目前的研究主要為細胞水平和動物模型研究，人體研究還有很遠的路要走。

雖然輻射誘導旁效應是一種弱生物效應，但其增加了放射治療及輻射防護的復雜性。在我國，65%～75%的腫瘤患者在治療過程中接受過放射治療，所以深入研究細胞自噬有助于進一步探索RIBE 的產生機制，既可增強放療對腫瘤細胞的殺傷效應，又能減輕RIBE 對正常組織器官的損傷，有望發掘臨床精準放療和防治輻射旁效應的新靶點。相信隨著機制研究的深入及放療技術的發展，可早期干預RIBE，同時又能提高放射治療療效的臨床實踐會越來越多。

利益沖突：無。

作者貢獻聲明：楊廷芳負責構思和撰寫論文；史月濱、陸婷負責校對；張勇、王麗負責修改論文和基金支持。