不同炮制方法對黃芪主要化學成分質量分數(shù)的影響1)

張美琦 任偉超 劉美琦 于欣欣 王思嘉 馬偉 蘇連杰

(黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱，150040)

黃芪，豆科(Leguminosae sp.)，黃耆屬(AstragalusLinn)，多年生草本植物[1]。黃芪是臨床常用的大宗藥材，性甘、微溫。歸脾、肺經(jīng)，具有補脾益氣、升陽、固表止汗等功效。黃芪中含有總多糖[2]、總皂苷[3]、總黃酮[4]三大類主要化學成分，這三大成分在臨床上的藥理作用十分豐富。在臨床用藥時，鹽處理[5]黃芪入腎經(jīng)、至下焦、補其虛。研究表明，鹽處理會使中藥的化學成分含量產(chǎn)生差異[6]，從而導致效用發(fā)生變化。因此，本研究通過炒、飯蒸兩種炮制方法對鹽浸黃芪飲片進行處理，與生黃芪比較，分析其中三大類主要化學成分的變化情況。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業(yè)有限責任公司)、AB204-L型分析天平(深圳市深博瑞儀器儀表有限公司)、150B搖擺式500 g高速中藥粉碎機(浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司)、美國奧泰ELSD6000蒸發(fā)光散射檢測器(杭州浣熊儀器科技有限公司)、DZTW型電子恒溫電熱套(力辰科技股份有限公司)、多功能電熱鍋(四川長虹電器股份有限公司)。

1.2 試驗材料與主要試劑

黃芪飲片來自黑龍江省，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學馬偉鑒定為蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao)的干燥根。主要試劑有D-無水葡萄糖、黃芪甲苷、蘆丁(中國食品藥品檢定研究院)、腌制鹽(山東省鹽業(yè)集團有限公司)、大米(湯原縣瑞龍食貿(mào)有限公司)及乙醇、丁醇、硫酸、蒸餾水、苯酚、香草醛、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等。

1.3 樣品炮制方法

炒制的鹽浸黃芪：取黃芪飲片300 g，加入150 mL鹽水(質量分數(shù)為5%)，不斷攪拌使鹽水完全吸入黃芪飲片中，充分潤透；把潤透后的黃芪飲片置于鍋中炒干后(水分不超過10%)，繼續(xù)炒制10 min(黃芪藥材表面為100 ℃)，取出晾干備用。

飯蒸的鹽浸黃芪：取黃芪飲片300 g，加入150 mL鹽水(質量分數(shù)為5%)，不斷攪拌使鹽水完全吸入黃芪飲片中，充分潤透，自然晾干。取400 g大米平鋪于容器中，加入800 mL水浸泡大米30 min，使米泡透，再用水浸透屜布平鋪于蒸屜中；把泡透的大米平鋪于紗布表面，呈直徑35.5 cm的圓，平均厚度8 mm，用另一塊水浸透的屜布平鋪于米上，將潤透鹽水的黃芪片平鋪于屜布上至于鍋中。電鍋中加入2 500 mL水，加熱至圓氣時開始計時，電鍋(800 W檔位)蒸制40 min，取出晾干備用。

1.4 樣品溶液制備

總多糖成分的提取：取樣品粉末(過5號篩(篩孔內徑(180.0±7.6)μm))2.0 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入40 mL水，密封浸泡24 h。在電熱套上加熱回流2 h，過濾，將藥渣中再次加入40 mL水，加熱回流，重復操作2次，合并提取液，濃縮；加250 mL的V(丁醇)∶V(氯仿)為1∶4的溶液充分振搖，用離心機離心15 min；將兩溶劑交界處的白色渾濁全部除去[7]，加入150 mL乙醇試劑(體積分數(shù)為90%)后，在冰箱中5 ℃靜置16 h。過濾得到沉淀物質用乙醇試劑(體積分數(shù)為90%)洗滌3次[8]，取沉淀物烘干，稱定質量，于1 000 mL容量瓶中定容，加水至刻度，即得。

總皂苷成分的提取：取樣品粉末(過5號篩)10.0 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水，密封浸泡24 h。在電熱套上加熱回流2 h，過濾，將藥渣中再次加入200 mL水，加熱回流，重復操作2次，合并提取液，濃縮，定容至100 mL容量瓶中；通過大孔吸附樹脂柱[9](大孔樹脂量，20 g裝柱方法，濕法裝柱；沖洗柱子溶劑，先采用體積分數(shù)為95%乙醇溶液，后用水沖洗至無醇味；浸泡時間24 h)，用100 mL水洗脫到無色，再用體積分數(shù)為70%乙醇洗脫，收集洗脫液；在水浴鍋上蒸發(fā)至干，用無水乙醇溶解定容至200 mL，即得。

總黃酮成分的提取：取樣品粉末(過5號篩)20.0 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水，密封浸泡24 h。在電熱套上加熱回流2 h，過濾，將藥渣中再次加入200 mL水，加熱回流，重復操作2次，合并提取液，濃縮，定容至200 mL；加到聚酰胺層析柱中[10]，放置48 h，用水洗脫柱子到無色，體積分數(shù)為體積分數(shù)為90%的乙醇洗脫，收集洗脫液體，用無水乙醇定容至2 500 mL，即得。

2 結果與分析

2.1 總多糖質量分數(shù)測定

總多糖成分測定條件：硫酸-苯酚法[11]測定總多糖成分的質量分數(shù)，檢測波長為491 nm。吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL質量濃度為1.0 g/L的D-無水葡萄糖標準品溶液，分別加水補至2.0 mL，配制成D-無水葡萄糖質量濃度為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g/L的標準品溶液；加入1.0 mL剛配的質量分數(shù)5.5%苯酚溶液，搖勻；迅速加入5.0 mL濃H2SO4溶液，震蕩5 min，隨后置于沸水浴中15 min；取出冷卻置室溫，定容至10 mL容量瓶中；隨行空白對照組，在491 nm波長下采用紫外可見分光光度計測定吸光度值；以D-無水葡萄糖標準品待測液質量濃度(ρ)為橫坐標，以吸光度值(A)為縱坐標，得到D-無水葡萄糖的標準曲線方程A=2.179 6ρ+0.073 4(0.10≤ρ≤0.35)，R2=0.999 4>0.9，說明線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.0 mL黃芪多糖樣品溶液，按標準曲線制備的方法進行操作，隨行空白對照組，在491 nm波長處重復以上操作6次，測定吸光度值(A)。精密度試驗的相對標準偏差為0.13%，表明儀器可靠，精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取2.0 mL黃芪多糖樣品溶液，按標準曲線制備的方法進行操作，隨行空白對照組，分別在491 nm波長處測定供試品溶液在0、1、2、3、4、5 h的吸光度值(A)。結果表明，在5 h內，穩(wěn)定性試驗的相對標準偏差為1.06%。在穩(wěn)定性試驗中，相對標準偏差值不超過3%時，則說明試驗穩(wěn)定性良好。因此，供試品檢測時間2 h，在穩(wěn)定性設定時間5 h之內，說明試驗可靠，穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：精密稱定同一樣品藥材粉末6份，每份約2.0 g，按標準曲線制備的方法進行操作，隨行空白對照組，測定吸光度值(A)，計算6份供試品的黃芪總多糖質量分數(shù)。結果表明，黃芪總多糖質量分數(shù)平均值為159.9 mg/g，重復性試驗測定吸光值的相對標準偏差為1.17%，說明該方法重復性較好。

加樣回收率試驗：取9份已知黃芪總多糖質量分數(shù)的樣品溶液1.0 mL，然后分別加入1.0 mL質量濃度為0.160 0、0.319 8、0.479 8 g/L的標準品溶液，按標準曲線制備的顯色方法進行顯色，隨行空白對照組，測定吸光度值(A)，計算黃芪總多糖回收率。結果表明，黃芪總多糖的平均回收率為99.48%；一般中藥材回收率要求控制在95%～100%，試驗中平均回收率的值符合要求，說明本方法準確率符合要求。

黃芪多糖樣品質量分數(shù)測定：將已經(jīng)制備的樣品溶液，按照標準曲線的測定方法進行測定，生黃芪總多糖質量分數(shù)為159.8 mg/g、炒制鹽浸黃芪總多糖質量分數(shù)為160.6 mg/g、飯蒸鹽浸黃芪總多糖質量分數(shù)為158.6 mg/g。

2.2 總皂苷質量分數(shù)測定

總皂苷成分測定條件：硫酸-香草醛法測定皂苷類成分的質量分數(shù)，檢測波長為583 nm。吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL質量濃度為1.0 g/L的黃芪甲苷標準品溶液，置于10 mL離心管中，分別加入無水乙醇至0.5 mL，配制黃芪甲苷質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的標準品溶液；加入體積分數(shù)為8%香草醛無水乙醇試劑0.5 mL，搖勻，于冰水浴中加入5 mL體積分數(shù)為72% H2SO4溶液；搖勻后，置于62 ℃水浴中20 min，加無水乙醇至10 mL，取出后立即冰浴冷卻至室溫。隨行空白對照組，在583 nm波長下采用紫外可見分光光度計測定吸光度值(A)，得到黃芪甲苷的標準曲線方程A=0.689ρ+0.160 6(0.2≤ρ≤1.0)，R2=0.999 6>0.9，說明線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取0.2 mL黃芪皂苷樣品溶液，按照標準曲線制備的方法進行操作，隨行空白對照組，在583 nm波長處重復以上操作6次，測定吸光度值(A)。精密度試驗的相對標準偏差為0.33%，表明儀器可靠，精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取0.2 mL黃芪皂苷樣品溶液，按照標準曲線制備的方法進行操作，隨行空白對照組，分別在583 nm波長處測定供試品溶液在0、1、2、3、4、5 h的吸光度值(A)。結果表明，在5 h內，穩(wěn)定性試驗的相對標準偏差為1.06%。在穩(wěn)定性試驗中，相對標準偏差值不超過3%時，則說明試驗穩(wěn)定性良好。因此，供試品檢測時間3 h，在穩(wěn)定性設定時間5 h之內，說明試驗可靠，穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：精密稱定同一樣品藥材粉末6份，每份約10.0 g，按照標準曲線制備的方法進行操作，隨行空白對照組，測定吸光度值(A)，計算6份供試品的黃芪總皂苷質量分數(shù)。結果表明黃芪總皂苷質量分數(shù)平均值為26.2 mg/g，重復性試驗的相對標準偏差為1.23%，說明該方法重復性較好。

加樣回收率試驗：取9份已知黃芪總皂苷質量分數(shù)的供試品溶液0.1 mL，然后分別加入0.1 mL質量濃度為0.655、1.310、1.965 g/L的標準品溶液，按照標準曲線制備的方法進行操作，隨行空白對照組，測定吸光度值(A)，計算黃芪總皂苷回收率。結果表明，黃芪總皂苷的平均回收率為99.20%；一般中藥材回收率要求控制在95%～100%，試驗中平均回收率符合要求，說明本方法準確率符合要求。

黃芪皂苷樣品質量分數(shù)測定：將已經(jīng)制備的樣品溶液，按照標準曲線測定方法進行測定，生黃芪總皂苷質量分數(shù)為25.5 mg/g、炒制鹽浸黃芪總皂苷質量分數(shù)為25.4 mg/g、飯蒸鹽浸黃芪總皂苷質量分數(shù)為24.6 mg/g。

2.3 總黃酮質量分數(shù)測定

總黃酮成分測定條件：亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定黃酮類成分的質量分數(shù)，檢測波長為510 nm。吸取0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL質量濃度為1.0 g/L的蘆丁標準品溶液，置于10 mL容量瓶中，加無水乙醇至2 mL，加入質量分數(shù)為5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻放置6 min；再加入質量分數(shù)10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻放置6 min；加入濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液4 mL，用體積分數(shù)為30%乙醇定容至10 mL容量瓶中，放置15 min。隨行空白對照組，在510 nm波長下采用紫外可見分光光度計測定吸光度值(A)，并對結果構建標準曲線方程；以蘆丁標準品待測液質量濃度(ρ)為橫坐標，以吸光度值(A)為縱坐標，蘆丁的標準曲線方程A=1.188 4ρ+0.045 2(0.25≤ρ≤0.65)，R2=0.999 3>0.9，說明線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取1.0 mL黃芪黃酮樣品溶液，按照標準曲線制備的方法進行操作；隨行空白對照組，在510 nm波長處重復以上操作6次，測定吸光度值(A)；精密度試驗的相對標準偏差為0.43%，表明儀器可靠，精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取1.0 mL黃芪黃酮樣品溶液，按照標準曲線制備的方法進行操作；隨行空白對照組，分別510 nm波長處測定供試品溶液在0、1、2、3、4、5 h的吸光度值(A)，在5 h內，穩(wěn)定性試驗的相對標準偏差為0.66%。在穩(wěn)定性試驗中，相對標準偏差值不超過3%時，則說明試驗穩(wěn)定性良好。因此，供試品檢測時間2 h，在穩(wěn)定性設定時間5 h之內，說明試驗可靠，穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：精密稱定同一樣品藥材粉末6份，每份約20.0 g，按照標準曲線制備的方法進行操作；隨行空白對照組，測定吸光度值(A)，計算6份供試品的黃芪總黃酮質量分數(shù)。黃芪總黃酮質量分數(shù)平均值為114.6 mg/g，重復性試驗的相對標準偏差為0.24%，說明該方法重復性較好。

加樣回收率試驗：取9份已知黃芪總黃酮質量分數(shù)的供試品溶液0.5 mL，然后分別加入質量濃度為0.459 2、0.918 4、1.377 6 g/L的標準品溶液0.5 mL，置于10 mL容量瓶中；按照標準曲線制備的方法進行操作，隨行空白對照組，測定吸光度值(A)，計算黃芪總黃酮回收率。結果表明，黃芪總黃酮的平均回收率為98.70%，一般中藥材回收率要求控制在95%～100%之間，試驗中平均回收率符合要求，說明本方法準確率符合要求。

黃芪黃酮樣品質量分數(shù)測定：將已經(jīng)制備的樣品溶液，按照標準曲線的測定方法進行測定，生黃芪總黃酮質量分數(shù)為114.5 mg/g、炒制鹽浸黃芪總黃酮質量分數(shù)為113.7 mg/g、飯蒸鹽浸黃芪總黃酮質量分數(shù)為113.6 mg/g。

3 討論

黃芪藥用歷史悠久，也是現(xiàn)代中醫(yī)臨床最常用的大宗藥材之一。祖國傳統(tǒng)處理藥材理論認為，生黃芪主要偏于固表止汗，蜜處理黃芪偏于補虛損、補中益氣[12]，而鹽處理黃芪主下行入腎，補腎及治崩帶淋濁。中藥材的化學成分種類繁多，在臨床用藥過程中，需要針對性地用藥，不同的處理方式也會使藥材的效用產(chǎn)生一定的差異性。本研究中，炒、飯蒸兩種炮制方法對鹽浸黃芪飲片進行處理，黃芪中總多糖、總皂苷、總黃酮的質量分數(shù)有所不同，藥材不同的處理方式，可使藥效產(chǎn)生不同的治療效果。中藥黃芪經(jīng)鹽處理后，黃芪總多糖質量分數(shù)測定結果，由大到小依次為炒制鹽浸黃芪、生黃芪、飯蒸鹽浸黃芪。在探討不同炮制方法對黃芪中多糖成分質量分數(shù)影響中發(fā)現(xiàn)，生黃芪總多糖質量分數(shù)高于鹽浸黃芪，其原因是多糖的熱穩(wěn)定性較好，也與處理后黃芪甲苷、氨基酸質量分數(shù)降低有關；在本研究中測定的炒制鹽浸黃芪的多糖質量分數(shù)也是增加。在飯蒸鹽浸黃芪處理試驗中，采用稻米進行蒸制，稻米中含有氨基酸比較豐富，在蒸制過程中稻米中的氨基酸對鹽制后的藥材降低的氨基酸質量分數(shù)有所補充，使鹽制過程中黃芪的氨基酸質量分數(shù)變化較小；因此，飯蒸鹽浸黃芪的總多糖質量分數(shù)有所降低。黃芪總皂苷質量分數(shù)，由大到小依次為生黃芪、炒制鹽浸黃芪、飯蒸鹽浸黃芪，在研究蒙古黃芪、生飲片及其炮制品的質量差異時，生飲片中黃芪甲苷的質量分數(shù)高于鹽浸黃芪，高溫對黃芪甲苷結構造成破壞，高溫會影響皂苷類化學成分，使其質量分數(shù)降低；本研究中測定，炒制鹽浸黃芪的總皂苷質量分數(shù)降低。在飯蒸鹽浸黃芪處理試驗中，長時間的高溫蒸制，使總皂苷的質量分數(shù)下降，因此飯蒸鹽浸黃芪的總皂苷質量分數(shù)最低。黃芪總黃酮質量分數(shù)，由大到小依次為生黃芪、炒制鹽浸黃芪、飯蒸鹽浸黃芪；在研究不同方法對黃芪中黃酮成分的影響時，發(fā)現(xiàn)鹽炙對黃酮類成分質量分數(shù)變化無顯著影響，本研究中測定炒制鹽浸黃芪的總黃酮質量分數(shù)略微下降。在飯蒸鹽浸黃芪處理試驗中，會使總黃酮質量分數(shù)略微下降。

總之，中藥黃芪的主要化學成分質量分數(shù)發(fā)生變化，會直接改變黃芪的臨床功效，鹽處理方式可以以改變黃芪的主要化學成分質量分數(shù)，影響其藥效。因此，在臨床使用中，要進行科學的用藥方式達到預期的治療效果。