環狀RNA在胰腺癌中的研究進展

王硯偉，梁雨榮

解放軍總醫院 肝膽胰外科醫學部，解放軍總醫院肝膽外科研究所，全軍數字肝膽外科重點實驗室，北京 100853

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是人類惡性程度最高的腫瘤之一[1]。其最主要的病理類型是導管腺 癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)，約占85%[2]。胰腺癌具有高度的侵襲性，以病死率高、預后差為特點，中位生存期為3～6個月，目前5年總生存率為8%左右[3-4]。胰腺癌僅占所有癌癥發病數的2%，但卻占癌癥相關死亡人數的5%，在無癥狀癌癥中居于首位[5]。近年來，其發病率逐漸上升，根據西方國家的統計，預計到2030年，胰腺癌將超過乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌，成為僅次于肺癌的第二大癌癥相關死亡原因[6]。目前中國每年的胰腺癌新發病例數和死亡人數均已經超過了美國，胰腺癌的健康負擔逐年增加[3]。現階段手術切除仍是胰腺癌最有效的治療措施[7]。然而，由于胰腺癌早期癥狀并無特異性，同時又缺乏有效的篩查策略，僅15%～20%的患者能夠接受手術切除，其余80%～85%的患者在發現時即為轉移性或局部晚期而失去手術機會，因此尋找一種行之有效的早期診斷方法和靶向治療策略是當下的迫切需求[8]。隨著基因芯片和RNA測序技術(RNA-seq)的發展，研究發現大量環狀RNA(circular RNA，circRNA)在胰腺癌組織和胰腺癌細胞系中表達異常，并且通過調控下游靶分子如微小RNA(micro RNA，miRNA)或RNA結合蛋白(RNA-binding protein，RBP)參與胰腺癌的發生、發展、耐藥、自噬及免疫逃逸，并與腫瘤TNM分期及患者的預后相關，有潛力成為胰腺癌診斷和治療的靶點，為胰腺癌的診治帶來了希望[9]。本文對胰腺癌組織中異常表達的circRNA展開討論，總結了其生物學特性和作用機制，并對其應用前景進行了探討。

1 circRNA的結構和功能

共價閉合circRNA最初在植物類病毒、酵母線粒體和D型肝炎病毒中被發現，一度被認為是錯誤剪接的產物，直到近些年其重要性才逐漸被發現并深入研究[10]。circRNA是一類長度為200～2 000 bp的特殊非編碼RNA分子，屬于長鏈非編碼 RNA(long noncoding RNA，lncRNA)的一種[11]。不同于典型的線性RNA，circRNA是信使RNA(messenger RNA，mRNA)前體反向剪接并由共價鍵連接的封閉環狀結構[12]。根據其來源不同，可分為外顯子circRNA、內含子circRNA、外顯子-內含子circRNA以及基因間circRNA，其中外顯子來源的circRNA占絕大多數[9]。由于circRNA分子是封閉的環狀結構，不具備5′端帽子和3′端poly(A)尾，因而不易被RNA酶水解，具有十分穩定的結構，可以廣泛存在于外泌體和血漿中，具有高度的保守性和組織特異性[13-14]。

circRNA的生物學功能：1)作為miRNA海綿(sponge)。由于circRNA含有豐富的miRNA結合位點，可以充當競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，吸附miRNA, 抑制其與下游靶基因的結合，從而間接地調節靶基因的表達水平[15]。2)與RNA結合蛋白(RNA-binding protein，RBP)相互作用。一些circRNA可以與RBP結合形成RNA-蛋白復合物，如circ-Foxo3和circ-MBL，circ-Foxo3能夠與多種類型的蛋白質結合，通過與CDK2、P21相互作用抑制細胞周期，阻斷細胞從G1期向S期的過渡，調控細胞的增殖[9]。3)調節基因轉錄。有研究發現，一部分定位于細胞核中的circRNA，如circ-EIF3J和circ-PAIP2，可以與抗U1小核糖核蛋白抗體(U1 snRNP)結合，進一步與RNA聚合酶Ⅱ(RNA PolⅡ)相互作用，上調其親本基因的表達[16]。4)蛋白質翻譯。有研究報道顯示，少數環狀RNA具有翻譯成蛋白質的潛力，如circ-ZNF609在內部核糖體進入位點(IRES)的驅動下，可以翻譯小鼠成肌細胞中的蛋白，這對circRNA是非編碼RNA的傳統觀念提出了質疑[17]。

2 胰腺癌領域相關的circRNA

2.1 circNFIB1 circNFIB1在circBase中的代碼為hsa_circ_0086375，定位于chr9：14146687-14155892。由于其來源于核因子I/B(NFIB)基因位點的第16～18外顯子，因此被命名為circNFIB1[18]。Kong等[18]分析了160例胰腺癌標本的circNFIB1表達，發現淋巴結轉移和高TMN分期的患者circNFIB1表達水平較低；qRT-PCR分析顯示，與配對的原發灶相比，淋巴結轉移瘤細胞中的circNFIB1水平更低，提示circNFIB1表達水平與淋巴轉移呈負相關。在進一步的體外實驗中，利用siRNAs沉默circNFIB1，與對照組相比，人淋巴管內皮細胞的管腔形成和遷移能力明顯增強；Transwell實驗也表明，circNFIB1基因沉默促進了PANC-1、CAPAN-2和SW1990細胞的遷移能力；以上結果表明circNFIB1抑制了胰腺癌細胞的轉移[18]。熒光原位雜交技術(FISH)和亞細胞分離實驗表明，circNFIB1主要位于細胞質中，細胞質定位的circRNA主要作為ceRNA發揮作用，并參與轉錄后調控[18]。Pull-down實驗表明，在Capan-2和PANC-1細胞中，miR486-5p被circNFIB1富集；熒光素酶報告實驗表明，與對照組相比，miR-486-5p過表達顯著降低了circNFIB1的熒光素酶活性；FISH分析也證實了circNFIB1和miR-486-5p在腫瘤細胞胞質中的共同定位，均提示circNFIB1靶向miR-486-5p發揮抑瘤作用[18]。進一步研究表明磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3R1)與miR-486-5p存在互補序列，二者在PDAC細胞中呈負性共表達[18]。PIK3R1是PI3K的受體單位，此前有報道稱其抑制PI3K/Akt信號通路的激活，從而抑制腫瘤進展[19]。血管內皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)是淋巴管生成所必需的，前期研究表明VEGF-C是PI3K/Akt信號通路的下游調節因子，qRT-PCR分析顯示，胰腺癌細胞中VEGF-C的表達水平在circNFIB1被沉默后增加[18]。綜上，circNFIB1可通過海綿作用吸附miR-486-5p，進而上調PIK3R1的表達水平，抑制PI3K/Akt通路，進一步下調VEGF-C的表達，抑制腫瘤淋巴轉移[18]。

2.2 Hsa_circ_100 782 circRNA_100782定 位于chr11：33307958-33309057，序列長度為1 099 nt[20]。Chen等[20]通過qRT-PCR研究了circRNA_100782在正常胰腺上皮細胞系(human pancreatic duct epithelial cells，HPDE)和BxPC3細胞系之間的表達，發現其在BxPC3細胞中顯著高表達。在隨后的基因敲除實驗中，利用siRNA沉默circRNA_100782，CCK-8和集落形成實驗表明circRNA_100782敲除BxPC3細胞系的增殖和集落形成能力顯著減弱，表明circRNA_100782是腫瘤細胞增殖的正向調節因子[20]。通過TargetScan數據庫推測miR-124具有circRNA_100782的結合位點[20]，既往有研究表明，miR-124通過靶向白細胞介素6受體(interleukin-6 receptor，IL6R)和信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在食管癌、肝細胞癌和胰腺癌等多種癌癥中發揮抗腫瘤效應[21]。Western blot結果表明，IL6-JAK2-STAT3信號通路與胰腺癌的細胞增殖有關，STAT3主要受上游IL6R的調控，IL6R的激活促進下游非受體型酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)蛋白磷酸化，磷酸化的JAK2蛋白進一步活化下游STAT3，增強了細胞增殖能力，促進腫瘤的發生和轉移[20]。前期研究發現，miR-124通過直接靶向IL6R和STAT3的3’-UTR發揮作用，過表達的miR-124可顯著下調IL6R、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的表達水平，進而抑制腫瘤增殖[21]。以上研究證實circRNA_100782能夠與miR-124結合并抑制其活性，進而激活IL6R和STAT3，促進腫瘤的增殖、侵襲和轉移。

2.3 circ_0030235 circ_0030235定 位 于chr13:49075877e49077050，基因符號為RCBTB2[22]。高通量circRNA微陣列結果顯示，與配對的非癌組織相比，circ_0030235在胰腺癌組織樣本中過表達[23]。Xu等[22]的研究表明，circ_0030235的表達水平與腫瘤分期(P=0.001)、淋巴結浸潤(P=0.013)呈正相關，與患者的長期預后呈負相關(P=0.010)[22]。CCK-8實驗、集落形成實驗以及流式細胞儀檢測結果表明，circ_0030235被沉默后，PANC1細胞系的增殖和集落形成能力顯著下降，凋亡明顯增多[22]。進一步研究表明，circ_0030235通過靶向miR-1253和miR-1294發揮促癌作用。在此前的研究中，miR-1253和miR-1294已被驗證在多種癌癥中發揮腫瘤抑制效應[22]。Liu等[24]研究發現miR-1253通過靶向Wnt5A抑制非小細胞肺癌的生長和侵襲。Shi等[25]研究報道了miR-1294在胃癌組織中的表達明顯低于相鄰正常組織，且其表達水平與腫瘤直徑、淋巴結轉移和遠處轉移等臨床病理參數相關。Wang等[26]發現miR-1294通過靶向c-Myc抑制口腔鱗狀細胞癌的增殖和轉移。綜上，circ_0030235作為miR-1253和miR-1294的分子海綿，下調二者在腫瘤組織中表達水平，減弱其抑癌效應，進而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。

2.4 circRNA_000864 circRNA_000864在circBase中的代碼為hsa_circ_0000662，基因定位于chr16：398402-398484，基因組長度為82 nt。Huang等[27]通過RT-qPCR檢測了circRNA_000864在59例胰腺癌組織及配對的癌旁正常組織中的表達，結果顯示，circRNA_000864在胰腺癌組織中的表達低于癌旁正常組織(P＜ 0.05)，且與TMN分期有關。為了進一步評估circRNA_000864是否影響胰腺癌細胞的生物學功能，用oe-circRNA_000864質粒轉染AsPC-1細胞，使circRNA_000864表達增加，隨后的Transwell、流式細胞檢測顯示，實驗組細胞增殖、遷移和侵襲能力下降，凋亡增加[27]。circInteractome數據庫預測circRNA_000864與miR-361-3p之間存在結合位點，雙熒光素酶報告實驗進一步驗證了二者的靶向關系[27]。EDU試驗、Transwell試驗和流式細胞儀檢測顯示，用miR-361-3p模擬物轉染ASPC-1細胞系后，阻滯于G0/G1期的細胞比例下降，S期細胞的比例上升，細胞遷移和侵襲增多，凋亡減少，而oecircRNA_000864轉染可逆轉這些效應[27]。TargetScan數據庫預測顯示miR-361-3p在胰腺癌細胞中與B細胞異位基因2(B-cell translocation gene 2，BTG2)有結合位點，可以與BTG2的3’-UTR區特異性結合[27]。在既往研究中，BTG2被認為是一種腫瘤抑制基因，Huang等[28]報道過表達的BTG2可顯著抑制肝癌細胞的增殖和集落形成能力，提高腫瘤細胞對5-氟尿嘧啶的敏感度；Zhou等[29]研究發現BTG2是miR-27a-3p在胃癌中的直接作用靶點，過表達的BTG2可觸發細胞G1/S期阻滯，誘導凋亡。

2.5 circ-ASH2L Chen等[30]通過對25組胰腺癌組織和癌旁正常組織進行qRT-PCR分析發現，circ-ASH2L在胰腺癌組織中的表達增高，并且與淋巴浸潤、TNM分期和遠期生存率顯著相關。CCK-8和Transwell試驗表明，在胰腺癌細胞系Capan-1及AsPC-1中上調circ-ASH2L的表達可促進其增殖和侵襲；流式細胞儀分析顯示，在AsPC-1細胞中過表達circ-ASH2L后，停滯在G1期的細胞減少，在Capan-1細胞中，沉默circ-ASH2L可使更多的細胞被阻滯在G1期[30]。為了進一步檢測circ-ASH2L在血管生成中的作用，用circ-ASH2L轉染人臍靜脈內皮細胞，與對照組相比，其管狀結構的生成明顯增多[30]。使用miRanda工具對circ-ASH2L的潛在靶點進行預測，并進行了qRTPCR分析，結果表明miR-34a是circ-ASH2L最可能的作用靶點，隨后的生物信息學分析和雙熒光素酶報告實驗也證明了這一點[30]。已有研究報道miR-34a可以通過調節Notch1的表達，作用于P21、c-MET、SNAIL和VEGF信號通路調節細胞周期，促進包括乳腺癌、胰腺癌在內的多種腫瘤的增殖、侵襲、遷移和血管生成[31-32]。Western blot實驗表明，circ-ASH2L可以上調Capan-1和AsPC-1細胞Notch1的表達，而miR-34a可降低Notch1的表達，并且miR-34a所介導的抑制作用可以被circ-ASH2L所逆轉[30]。因此，circ-ASH2L通過作為miR-34a的ceRNA，靶向Notch1通路，調節P21、c-MET、SNAIL和VEGF的表達，最終促進腫瘤的增殖、侵襲和血管生成。

2.6 circ-ADAM9 Xing等[33]研究表明絲氨酸蛋白酶3(serine protease 3，PRSS3)在胰腺癌細胞系和組織中的表達顯著增加，并與腫瘤的侵襲性呈正相關。通過對Targetscan和miRanda數據庫的分析發現PRSS3的3’-UTR與miR-217之間存在互補序列，熒光素酶報告基因檢測表明，miR-217過表達顯著降低了野生型載體的熒光素酶活性，但對突變型載體的熒光素酶活性沒有影響，驗證了PRSS3 3’-UTR中的“UGCAGU”序列是miR-217針對PRSS3的作用位點[33]。與鄰近正常組織相比，miR-217在胰腺癌組織中的表達顯著下調，并且與臨床分期、淋巴結轉移以及預后相關，提示miR-217是腫瘤發生過程中一個重要的異常miRNA，其下調可能是導致PRSS3過表達的原因之一[33]。在進一步的實驗中，miR-217的敲除增加了PC細胞中PRSS3的表達，miR-217沉默的MiaPaca2細胞系表現出較對照細胞更強的增殖、遷移和侵襲能力，并且這些效應隨著PRSS3基因敲除而減弱[33]。RNA Pull-down分析和熒光素酶報告實驗表明circ-ADAM9與miR-217關系密切，在胰腺癌組織中circ-ADAM9的表達明顯高于匹配的非癌組織，且與TNM分期、淋巴結轉移以及預后相關[33]。qRT-PCR和Western blot結果顯示，circ-ADAM9的過表達顯著提高了PRSS3的表達水平，并且這種現象可被miR-217的表達所抑制；相反，circ-ADAM9的敲除顯著降低了PRSS3的表達，而miR-217的缺失可以挽救這一現象[33]。此前已有研究表明PRSS3是一種促癌基因，能夠通過激活ERK/VEGF通路促進胰腺癌細胞的增殖和轉移[34]。

2.7 circBFAR circBFAR在circBase中的代碼為hsa_circ_0009065，序列長度為336 nt，由于其來源于BFAR基因外顯子2，被命名為稱為circBFAR[35]。Guo等[35]通過對6對胰腺癌樣本和匹配的癌旁正常組織樣本進行微陣列分析，篩選出了20個可能存在異常表達的circRNA，之后在含有208例PDAC患者的隊列中進行進一步驗證，發現只有circBFAR的表達差異有統計學意義。集落形成實驗和Transwell實驗表明，circBFAR能促進體外腫瘤細胞的增殖和遷移；體內實驗表明，與對照組裸鼠相比，circBFAR基因敲除的裸鼠腫瘤重量和體積更小，Ki-67水平較低[35]。Pull-down實驗和熒光素酶報告實驗均表明miR-34b-5p是PANC-1和BxPC-3細胞中唯一與circBFAR特異性結合的miRNA，qRT-PCR分析也進一步證實，胰腺癌組織中miR-34b-5p的表達明顯低于癌旁正常組織，且與TNM分期呈負相關[35]。進一步的研究表明，胰腺癌細胞中miR-34b-5p過表達和circBFAR敲低均顯著下調了間充質-上皮轉化因子(mesenchymal to epithelial transition factor，MET)的表達[35]。MET被認為是一種關鍵的酪氨酸激酶，在細胞增殖過程中發揮著重要作用，既往有研究表明，MET在胰腺癌細胞中過表達，對腫瘤的發生和發展起促進作用[36]。Western blot結果表明，miR-34b-5p的過表達或circBFAR的敲除都顯著降低了MET及其下游信號轉導蛋白磷酸化Akt(蛋白激酶B，PKB)的水平(Ser 473)，而對總Akt的水平無明顯影響[35]。因此，circBFAR通過作為miR-34b-5p的分子海綿，異常激活MET/Akt通路，進而促進胰腺癌細胞的增殖和轉移。

2.8 circSFMBT1 circSFMBT1在circBase中的代碼為hsa_circ_0066147，序列長度為234 bp，來源于SFMBT1基因第9~10外顯子[37]。Xu等[37]通過對32例胰腺腫瘤標本和鄰近非腫瘤對照標本進行qRT-PCR分析發現，腫瘤樣本中的circSFMBT1和P21-激活激酶1(PAK1)水平顯著上調，而miR-330-5p水平下調，同樣的結果在4個胰腺癌細胞系(PANC-1、AsPC-1、Capan1和BxPC-3)和HPDE中得到了印證。生物信息學分析(基于CircInteractome數據庫)和雙熒光素酶報告實驗表明circSFMBT1和miR-330-5p之間存在互補的結合位點[37]。以sh-circSFMBT1轉染胰腺癌細胞進行基因敲除，結果表明，與轉染shNC的對照組相比，實驗組細胞miR-330-5p的表達水平升高，細胞形成的集落數目減少，凋亡百分率升高，同時，Western blot結果顯示，敲除circSFMBT1顯著降低了胰腺癌細胞中增殖相關蛋白的水平，包括CyclinD1、c-Myc、Ki-67和Bcl-2，上調了凋亡相關蛋白的水平，如Bax[37]。進一步的研究表明，miR-330-5p在PC細胞中的表達顯著降低了PAK1的表達水平，通過生物信息學分析，初步確定了miR-330-5p和PAK1 mRNA之間存在互補的結合位點，雙熒光素酶報告實驗則直接證實了二者的相互作用[37]。PAK1是絲-蘇氨酸激酶家族的成員之一，在調節細胞骨架重構等生物學過程中起著關鍵作用，先前的研究表明PAK1能夠促進上皮-間充質轉化，進而導致腫瘤的進展和轉移，PAK1通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)和MET促進乳腺癌的惡性轉變[38]。綜上，circSFMBT1作為miR-330-5p的分子海綿，下調miR-330-5p的表達，解除了其對PAK1信號通路的抑制，最終激活MAPK和MET，從而促進了胰腺癌的增殖、進展和轉移。

2.9 circEIF6 circEIF6又被稱為circRNA真核起始因子6，在circBase中的代碼為hsa_circ_0060055[39]。Zhang等[39]通過對39例胰腺腫瘤組織及與之配對的癌旁正常組織進行qRT-PCR分析發現，在胰腺癌組織中circEIF6的表達顯著增強，且與TNM分期呈正相關，在診斷實驗中ROC曲線下面積(AUC)為0.909 3(95% CI：0.845～0.973 5)，表明circEIF6對于胰腺癌具有一定的診斷價值[39]。在基因敲除實驗中，用siRNA沉默circEIF6，結果表明，與轉染si-NC的對照組細胞相比，實驗組細胞增殖能力減弱，遷移和侵襲能力也受到明顯抑制，細胞凋亡增加[39]。生物信息學檢測和熒光素酶報告實驗表明circEIF6與miR-557之間存在相互作用的靶點[39]。根據之前的報道，miR-557可以抑制胰腺癌和肺癌的發展。Yang等[40]的研究證明miR-557過表達通過靶向表皮生長因子受體抑制了胰腺癌細胞的增殖和侵襲能力。Zhang等[39]的研究表明，miR-557沉默可逆轉由于circEIF6敲除所導致的腫瘤細胞增殖抑制，細胞的遷移和侵襲能力也提高，細胞凋亡減少。qRT-PCR和熒光素酶報告實驗提示miR-557與溶質載體家族7成員11(SLC7A11)存在相互作用的靶點，在胰腺腫瘤組織中SLC7A11的表達高于癌旁正常組織，并且在兩種胰腺癌細胞系(Hs 766T和SW1990)中SLC7A11的表達水平也明顯高于HPDE，與miR-557的表達呈負相關，與circEIF6的表達呈正相關[39]。miR-557過表達可顯著抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而SLC7A11轉染可減弱這些抑制作用，減少腫瘤細胞凋亡[39]。進一步的研究表明，miR-557過表達下調胰腺癌細胞中磷酸化蛋白激酶B(PKB，Akt)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的水平，而導入SLC7A11質粒后，胰腺癌細胞中p-Akt/Akt和p-PI3K/PI3K水平基本恢復，提示miR-557通過靶向SLC7A11抑制了PI3K/Akt通路的活性和惡性潛能[39]。

3 結論

盡管目前用于胰腺癌診斷和治療的circRNA還處于研究起步階段，但已經取得了一些初步的進展，已有研究證實胰腺癌組織與癌旁組織的circRNAs的表達譜有顯著差異。進一步研究表明，胰腺癌中的circRNAs可以通過與miRNAs結合，作用于不同的信號軸，調節腫瘤細胞的侵襲、轉移、免疫逃逸和化療耐藥等行為，識別這些信號通路可能為胰腺癌的治療提供新的靶點。然而，目前尚缺乏強有力的動物實驗和臨床研究證據證實circRNAs在臨床診斷和治療中的確切作用，且circRNA在胰腺癌的發生和進展中的作用機制還有待進一步研究。鑒于circRNA的獨特優勢和廣泛功能，筆者認為circRNA在胰腺癌的早期診斷和靶向治療方面具有廣闊的應用前景。