馬西替坦聯合維利西呱治療缺氧性肺高壓大鼠的作用機制

李 晨，李 鑫，劉春蕾，楊明會解放軍總醫院研究生院，北京 0085；解放軍總醫院第六醫學中心 中醫科，北京 0085；解放軍總醫院醫學創新研究部 轉化醫學研究中心，北京 0085

缺氧性肺高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是由于暴露于低壓缺氧環境中而引起的平均肺動脈壓力(mean pulmonary artery pressure，mPAP)≥30 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)的一種生存率極低的慢性進展性疾病[1]，屬于肺性高血壓(pulmonary hypertension，PH)的第三種類型[2]。世界上大約有1.4億居民永久生活在海拔高于2 500 m的環境中，每年超過4 000萬的游客去往高原地區，這些人群均有可能發展為HPH[3]，成為世界重大公共衛生問題，臨床上沒有特定的治療HPH的有效療法，因此尋找可靠有效的靶點藥物是臨床研究的重點。治療PH的藥物主要靶向縮血管分子或擴血管分子，代表藥物包括馬西替坦(Macitentan)、賽樂西帕(Selexipag)和維利西呱(Vericiguat)。內皮素1(endothelin-1，ET-1)作為一種對缺氧高度敏感的血管活性分子[4]，其激活導致肺血管收縮和平滑肌細胞增殖，馬西替坦作為ET-1拮抗劑，可顯著降低PH患者的發病率和死亡率[5]。PH患者內皮一氧化氮(NO)生成顯著減少，NO作為一種關鍵血管擴張劑，可通過激活可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)，最終促進小動脈的血管舒張，抑制細胞增殖。維利西呱作為sGC刺激劑，可在不依賴NO的情況下促進血管重塑和舒張[6]。目前單一藥物治療PH往往效果不佳，多靶點藥物聯合是未來抗PH藥物研究的重要方向，本課題組既往曾報道馬西替坦用于治療HPH的作用[7]，而目前尚缺乏藥物聯合治療HPH的報道，鑒于此，本研究探討馬西替坦聯用維利西呱治療HPH的作用機制，為進一步研發應用提供理論支持。

材料與方法

1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體質量(220±20) g，購自維通利華實驗動物有限公司，所有動物實驗程序均通過解放軍總醫院動物倫理委員會(IACUC)批準(2017-X13-05)。動物置于動物飼養籠，隨后置入低壓氧實驗動物倉中，保持室 內溫度18℃~22℃。

2 藥品、試劑和主要儀器 馬西替坦、維利西呱(上海藥明康德新藥開發有限公司；0.9%氯化鈉注射液溶解)； 戊巴比妥鈉(Sigma，美國)；4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)，EDTA抗原修復液、BSA封閉液(Thermo Fisher)；二甲苯、中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司)，HE染色試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)；蛋白酶和磷酸酶抑制劑、RIPA裂解緩沖液(碧云天生物技術研究所)。小動物低壓氧艙(煙臺冰輪高壓氧艙有限公司)；小動物超聲(Visualsonic，加拿大)；小動物呼吸機(Kent Scientific，美國)；多導生理信號采集處理系統、壓力容積導管(AD Instruments，美國)；正置熒光顯微鏡(Nikon，日本)；高通量掃描電子顯微鏡(北京聚束科技有限公司)；掃描儀( Innopsys，法國)。

3 分組及給藥 60只健康雄性SD大鼠隨機分為5組：空白組、模型組、Macitentan組(10 mg/kg)、Vericiguat組(10 mg/kg)、Maci&Veri組(10 mg/kg+10 mg/kg)，每組12只。空白組常氧飼養，其余各組在同一環境下低氧艙中飼養2周，氧濃度為10%，二氧化碳濃度為2%，模擬5 500 m高原環境。造模結束后各組灌胃相應劑量的藥物，1次/d，連續2周，空白組和模型組進行等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃，飼養過程保持12 h的明暗交替，墊 料每周更換2次。

4 肺血流及右心功能檢測 給藥結束后，將大鼠在無菌條件下應用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)給予腹腔麻醉，脫毛后將大鼠固定于操作臺上，運用小動物超聲30 MHz探頭獲取右心長軸、短軸以及四腔心切面，分別測量并記錄肺加速時間/肺射血時間(pulmonary blood flow acceleration time/pulmonary ejection time，PAT/PET)、右心室縮短率(right ventricular fractional shortening，RVFS)、右心室射血分數(right ventricular ejection fraction，R VEF)。

5 肺動脈壓力測定 超聲心動圖測量完成后，將大鼠仰臥位固定于手術平臺上，逐層切開頸部皮膚后行氣管插管接小動物呼吸機。于胸骨左緣第4肋間切開，暴露肺和心臟，用無菌濕棉球墊壓左肺，鑷子撕開心包充分暴露心臟，用1 mL注射器針頭在右心室流出道處扎一個小孔，沿小孔送入壓力-容積導管測壓，并向前延伸順勢進入肺動脈測壓。采用多導生理信號采集處理系統測量壓力，分別記錄并計算出平均肺動脈壓力(mean p ulmonary artery pressure，mPAP)。

6 右心室肥厚指數(right ventricular hypertrophy index，RVHI)測量 血流動力學檢測完成后，處死大鼠，取下心臟，去除心耳和心房，準確裁剪并稱量右心室、左心室、室間隔的重量，計算R VHI。RVHI=RV/(LV+IVS)。

7 肺小血管免疫熒光觀察 將肺組織切片二甲苯脫蠟，各級乙醇脫水后置于EDTA抗原修復液中。PBS脫色，甩干后滴加5% BSA封閉30 min，加入一定濃度的一抗：α-平滑肌肌動蛋白、增殖細胞核抗原濕盒內4℃過夜。PBS脫色后滴加二抗避光室溫孵育60 min，PBS脫色洗滌后甩干、封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，中膜厚度百分比(WT%) = (外彈力膜直徑-內彈力膜直徑 )/外彈力膜直徑×100%。

8 心肌組織病理檢測 將右心組織放入4%多聚甲醛中固定、包埋，用于觀察。心肌纖維化：HE染色將心臟組織切片二甲苯脫蠟，各級乙醇脫水后蘇木素染色，1%鹽酸-乙醇分化液分化，1%稀氨水促藍液返藍，沖洗后0.5%伊紅液染色，各級乙醇脫水，二甲苯浸泡，中性樹膠封固。心肌細胞超微結構：心臟組織切片用1%四氧化鋨在4 ℃條件下固定2 h，用二甲砷酸鈉洗滌液清洗2次，各級乙醇脫水后用純乙醇和醋酸正戊酯混合液置換，純醋酸正戊酯置換3次，在干燥儀中干燥2 h后固定于樣品臺上，放入離子濺射儀中 噴金3 min，用掃描電鏡觀察并照相記錄。

9 蛋白芯片檢測超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、重組人骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)、Rho卷曲蛋白激酶 2(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2，ROCK2)、過氧化物酶體增殖劑激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPAR-α)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS) 使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解大鼠右心組織，使用基于生物素標記的定制抗體陣列對樣品進行分析。即對每個樣品中的30 μg總蛋白進行生物素化處理，然后添加到預先用捕獲抗體預印的重復玻片上，將結合的蛋白與鏈霉親和素綴合的熒光染料一起孵育，在532 nm的激發波長下掃描陣列，并 使用InnoScan300微陣列掃描儀測量熒光。

10 統計學分析 采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據處理，結果以±s 表示，組間差異采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較用L SD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠mPAP、RVHI、右心室功能指標比較 與空白組大鼠相比，模型組大鼠的mPAP和RVHI顯著升高，RVEF、RVFS、PAT/PET顯著下降(P＜0.01)；與模型組比較，馬西替坦組mPAP和RVHI降低(P＜0.01)，RVEF、RVFS、PAT/PET升高(P＜0.05)；維利西呱組mPAP和 RVHI有降低趨勢(P＞0.05)，RVEF、RVFS、PAT/PET升高(P＜0.05)；聯合用藥組mPAP、RVHI降低，RVEF、RVFS、PAT/PET升高(P＜0.01)；與馬西替坦和維利西呱單獨用藥組比較，聯合用藥組mPAP和RVHI顯著降低，RVEF、RVFS、PAT/P ET明顯升高(P＜0.05)(表1)。

表1 各組大鼠平均肺動脈壓、右心室肥厚指數、右心功能指標比較(n=5)Tab. 1 Comparison of mPAP, RVHI, and right ventricular function indexes of rats in each group (n=5)

2 各組大鼠肺小血管免疫熒光觀察 與空白組相比，模型組大鼠的肺小動脈血管壁逐漸增厚，管腔逐漸狹窄，WT%值(P＜0.001)增加；與模型組相比，馬西替坦組血管壁厚度、WT%值(P=0.057)降低，維利西呱組血管壁厚度、WT%值有降低的趨勢但無統計學差異，聯合用藥組血管壁厚度、WT%值(P=0.002)明顯降低；與馬西替坦和維利西呱單獨用藥組比較，聯合用藥組WT%值(P=0.048、0.000 7)均顯著降低(圖1)。

圖1 各組大鼠肺小血管病理學改變(免疫熒光，400×)和WT%比較免疫熒光染色用于標記肺小血管中PCNA(紅色)和α-SMA(綠色)的表達，細胞核用DAPI染色(藍色)。aP ＜0.05，vs空白組；bP ＜0.05，vs模型組；cP ＜0.05，vs Maci&Veri組Fig.1 Pathological changes of pulmonary small vessels of rats in each group (IF, 400×) and comparison of WT%Immunofluorescence staining of small pulmonary blood vessels is used to mark the expression of PCNA (red) and α-SMA (green), and the nucleus is stained with DAPI (blue);Comparison of WT% of rats in each group (aP ＜0.05, vs control; bP ＜0.05, vs vehicle; cP ＜0.05, vs Maci&Veri)

3 各組大鼠心肌組織病理形態改變 空白組大鼠心肌細胞正常，模型組大鼠心肌細胞排列紊亂且心肌細胞肥大，用藥后各組大鼠心肌組織損傷改善，聯合用藥組心肌組織損傷改善最明顯(圖2)。空白組大鼠心肌細胞超微結構正常，模型組大鼠心肌細胞中線粒體排列紊亂、固縮色加深，用藥后心肌細胞損傷減輕，聯合用藥組心肌組織損傷減 輕程度最明顯(圖3)。

圖2 各組大鼠心肌組織纖維化病理學改變(HE染色，400×)Fig.2 Pathological changes of myocardial fibrosis of rats in each group (HE staining, 400×)

圖3 各組大鼠心肌細胞超微結構改變(掃描電鏡，10 000×)Fig.3 Cardiomyocytes ultrastructural changes of rats in each group (SEM, 10 000×)

4 各組大鼠右心組織相關蛋白表達水平比較 與空白組相比，模型組iNOS(P=0.031)、ROCK2(P=0.019)表達增加，SOD(P＜0.001)、BMP2(P＜0.001)、PPAR-α(P＜0.001)表達降低。與模型組比較，馬西替坦組iNOS(P=0.018)、SOD(P=0.000 3)、BMP2(P＜0.001)、PPAR-α(P=0.001)表達升高，ROCK2(P=0.048)表達降低；維利西呱組PPAR-α(P=0.006)表達升高，iNOS、SOD、BMP2、ROCK2表達無統計學差異；聯合用藥組iNOS(P=0.016)、SOD(P＜0.001)、BMP2(P＜0.001)、PPAR-α(P＜0.001)表達進一步增加，ROCK2(P=0.039)表達降低。與馬西替坦單獨給藥組比較，聯合用藥組BMP2(P=0.016)表達明顯升高；與維利西呱單獨給藥組比較，聯合用藥組iNOS(P=0.011)、PPAR-α(P=0.016)、BMP2(P=0.016)表達顯著升高，ROCK2( P=0.028)表達降低(圖4)。

圖4 各組大鼠右心組織iNOS、SOD、BMP2、PPAR-α、ROCK2的表達水平 (aP ＜0.05，vs空白組；bP ＜0.05，vs模型組；cP ＜0.05，vs Maci&Veri組)Fig.4 Expression of iNOS, SOD, BMP2, ROCK2, PPAR-α protein in right ventricle tissues of rats in each group (aP ＜0.05, vs control; bP ＜0.05,vs vehicle; cP ＜0.05, vs Maci&Veri)

討 論

缺氧刺激引起肺血管收縮和阻力增加，持續缺氧還會引起肺小動脈和靜脈水平的血管重塑，以及成纖維細胞和平滑肌細胞的增殖，導致不可逆的肺血管增厚狹窄，這些基礎病理改變在肺動脈壓力持續升高過程中發揮著重要作用。馬西替坦作為治療PH的有效藥物，具有較高的組織滲透性和較低的肝毒性風險[8]，臨床報道維利西呱作為sGC刺激劑可增加內源性NO的敏感度，刺激環狀鳥苷單磷酸的產生，促進血管舒張，從而降低患者的心血管風險[9]。單一靶向藥物的治療多通過舒血管作用維持正常血流供應緩解病情進展，而其源頭內皮功能障礙和其終點右心衰竭均未得到有效改善，成為抗PH藥物在臨床應用中受限的重要原因[10]。據報道多靶點藥物聯合與單藥治療相比，可通過協同作用提高療效，降低臨床惡化率，成為未來的治療方向[11]。本研究通過構建HPH大鼠模型，發現模型組大鼠血流動力學異常、右心肥厚，右心功能指標如RVEF、RVFS、PAT/PET明顯降低，伴有肺小血管壁增厚、心肌損傷等癥狀，顯示HPH大鼠模型構建成功。

本實驗顯示，馬西替坦組可有效緩解缺氧引起的mPAP、RVHI升高以及右心室功能損傷。維利西呱組對mPAP、RVHI升高的影響不大，但可有效降低缺氧引起的右心室功能改變，維利西呱的治療作用以左心疾病引起的PH為主，其是否適用于其他類型的PH仍有待研究[6]。雖然維利西呱在單獨使用時治療效果不佳，但聯合用藥后可明顯降低肺動脈壓力并改善右心功能，且效果優于馬西替坦組。病理檢測結果也顯示聯合用藥后可明顯抑制心肌肥厚、肺小血管重構及心肌線粒體損傷，效果優于馬西替坦、維利西呱單獨給藥組，以上均表明了馬西替坦與維利西呱聯用具有協同作用。

NO是體內發現的第一個氣體信息分子，是細胞間信息傳遞的重要調節因子，廣泛參與體內多個系統的生理和病理過程[12]。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是NO合成的關鍵酶，其活性變化直接調節NO的生成量及其生物學效應，NOS又分為結構型和誘導型兩種亞型，iNOS在病理條件下由炎癥、腫瘤等誘生[13]。本研究結果表明，在缺氧環境中，模型組iNOS合成增加，是機體一種代償性的保護機制。與模型組相比，馬西替坦組iNOS表達量進一步增加，維利西呱組iNOS表達量增加不明顯，聯合用藥組可進一步增加iNOS表達量。這可能與Macitentan聯用Vericiguat協同增加iNOS的表達，導致體內NO合成增加相關。

PPAR-α是調節脂肪酸的關鍵基因，在右心室肥大過程中表達量減少，PPAR-α缺失會引起心肌肥大[14-15]。SOD是反映人體內自由基代謝狀態的重要指標之一，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，其水平高低可間接反映機體內清除自由基的能力，檢測SOD水平可了解機體損傷情況。心肌缺血缺氧時機體自由基代謝紊亂，SOD水平下降，治療后SOD水平可明顯升高[16-17]。骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)屬于轉化生長因子-β超家族，其在骨的再生和修復中起重要作用。研究還發現BMP參與調節多種細胞增殖、分化和凋亡的生物學過程。缺氧會引起BMP2表達量下降，即缺氧可抑制BMP2的表達[18]。ROCK具有絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶活性，是一種與細胞凋亡相關的結合蛋白，ROCK2是活化的Caspase3、Casepase2等的裂解產物，與Caspase介導的凋亡相關[19]。本研究檢測結果顯示，持續缺氧引起右心室組織中iNOS、SOD、BMP2、PPAR-α的表達明顯降低，ROCK2增加。馬西替坦可提高iNOS、SOD、BMP2、PPAR-α的表達，降低ROCK的表達，維利西呱作用不顯著，聯合用藥后可進一步增加iNOS、SOD、BMP2、PPAR-α的表達，并降低ROCK2的表達，提示馬西替坦聯用維利西呱對右心室肥厚的保護作用更佳。

綜上所述，本研究證實馬西替坦聯用維利西呱具有協同作用，能更好地發揮藥物的舒血管作用，可降低肺動脈壓力、減少右心肥厚、改善肺小血管重構和心肌損傷，這可能與兩者聯用能減少體內自由基、脂肪酸代謝，并緩解細胞增殖及凋亡等損傷相關，為今后抗HPH的聯合藥物應用和進一步研究提供重要的依據和參考。