微小RNA、長鏈非編碼RNA及二者相互作用調控成骨細胞功能的研究進展

王藝璇，王 可，張 舒

空軍軍醫大學 航空航天生物動力學教研室，航空航天醫學教育部重點實驗室，陜西西安 710032

成骨細胞起源于間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，是新骨形成的關鍵細胞，對骨骼的生長和維持至關重要。成骨細胞在許多骨疾病，特別是在骨質疏松癥、骨發育不良和原發性骨腫瘤的發病機制中起著至關重要的作用[1]。在骨組織中，骨形成取決于成熟成骨細胞的數量和功能，與成骨細胞的形成、壽命和活性密切相關。而成骨細胞的數量和活性均由細胞轉錄和表觀遺傳機制控制，并受到激素、機械應力和細胞間相互作用等方式調節[2-4]。

人類基因組中只有1% ～ 2%的基因可編碼蛋白質，其余98%曾被認為是“垃圾”DNA，然而越來越多的特異性非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)被認為是某些生物學過程的關鍵性調控因子，包括調控基因表達、細胞周期、染色質重塑和表觀遺傳修飾等[5]。ncRNAs中有一部分是管家ncRNA(house-keeping non-coding RNA)，包 括核糖體RNA、轉運RNA、胞質小RNA和核內小RNA等，這些RNA分子直接或間接參與蛋白質的表達。大部分ncRNA則是在一定條件下誘導表達，可以調節蛋白質編碼基因的表達，因而被稱為調節性ncRNA(regulatory non-coding RNA)，依據分子大小可分為短鏈非編碼RNA和長鏈非編碼RNA[5]。短鏈非編碼RNA分子小于50 nt，主要分為微小RNA(microRNAs，miRNAs)、內源性小干擾RNAs(endo-siRNAs)和PIWI相互作用RNAs(piRNAs)。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)則主要指分子大于200 nt的調節性非編碼RNA。microRNAs和lncRNAs在成骨細胞蛋白質基因表達中發揮著重要的調節作用，其相關研究較多也較為深入，本文就近年來microRNAs、lncRNAs及其相互作用調控成骨細胞功能的研究進 行綜述。

1 microRNAs調控成骨細胞功能

microRNAs是長度為22 nt左右(18 ～ 25 nt)的內源性非編碼RNA，可通過與特定信使RNA 3’UTR區結合形成miRNA誘導的沉默復合物，負向調控基因表達，從而誘導其降解或抑制其翻譯[6]。哺乳動物miRNAs的合成受到精細的調控，一般來說是在RNA聚合酶Ⅱ催化作用下轉錄產生miRNA的初級前體(pri-miRNAs)，經RNAseⅢ酶Drosha和pri-miRNA結合蛋白DGCR8組成的微處理器加工為具有發卡結構的前體miRNAs(premiRNAs)，然后通過輸出蛋白(exportin 5)轉運到細胞質中。在細胞質中，pre-miRNAs被Dicer切割為成熟的RNA雙鏈，與AGO蛋白結合，將特定的miRNA鏈整合到RNA誘導沉默復合物中，進 而靶向調節靶基因mRNA表達[7]。

1.1 microRNAs在成骨分化過程中的改變 成骨細胞的分化過程以成骨細胞特異基因的順序激活為標志，經過細胞增殖、細胞外基質沉積、成熟和礦化后，一部分走向凋亡，另一部分則被周圍礦化基質包埋形成骨細胞。在成骨細胞分化過程中，眾多miRNAs的表達會發生改變。Oskowitz等[8]研究發現如果抑制人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)中miRNAs的合成，其成骨分化能力減弱，并發現hMSCs向成骨細胞分化過程中有19個miRNAs表達上調。Gong等[9]通過Satb2誘導骨髓基質干細胞向成骨細胞分化，發現了miR-27a等10個下調的miRNAs及miR-17等18個上調的miRNAs，生物信息學分析顯示這些miRNAs的靶基因參與了多條成骨分化通路，與骨形成及骨骼發育密切相關。而通過BMP2誘導骨髓基質干細胞向成骨細胞分化的過程中有22個miRNAs表達發生了顯著變化，且其中具有代表性的miR-133和miR-1 35均可促進骨形成[10]。

1.2 microRNAs調控成骨細胞分化 成骨細胞分化過程中，miRNAs表達發生改變，且在成骨細胞分化基因轉錄后調控中發揮著關鍵作用。Runx2是成骨細胞分化的主開關，可以調節成骨細胞中ColⅠ、ALP和骨橋素等多個分化相關基因的表達，miR-433、miR-103a、miR-628-3p、miR-155、miR-204、miR-205-5p、miR-505和miR-30家族等可以降低間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)及成骨細胞中Runx2的表達并抑制成骨分化[11-18]。成骨細胞分化過程還受到骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號的調節，miR-542-3p、miR-98可分別靶向抑制BMP-7及BMP-2[19-20]，miR-222-3p、miR-155、miR-106b-5p和miR-17-5p則可通過特異性阻礙Smad5的翻譯中斷BMP信號通路，從而導致成骨抑制[21-23]。同時部分miRNAs可通過靶向成骨分化過程中的一些關鍵基因抑制成骨細胞分化，如miR-637靶向Osterix[24]、miR-186靶向SIRT6[25]、miR-143靶向k-RAS[26]、miR-3 077-5p和miR-705靶向HOXA10[27]，miR-214抑制ATF4和成纖維細胞生長因子受體1(fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1)[28-29]。另有研究表明，miRNAs不僅可以通過靶向成骨因子抑制成骨細胞分化，還可通過靶向成骨抑制因子促進成骨細胞分化。組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)是一種特殊的蛋白質，能夠負向調控Runx2等基因的表達，并可受到miRNAs調控[30]。miR-449a可抑制成骨細胞HDAC1的表達，維持組蛋白乙酰化狀態，刺激Runx2基因表達[31]。miR-233可抑制小鼠MC3T3-E1前成骨細胞中的HDAC-2表達，miR-873-3p可抑制大鼠成骨細胞UMR106-01中HDAC4的表達，進而促進成骨細胞分化[32-33]。miR-143則可通過抑制HDAC7促進成骨細胞分化，且可以促進內皮細胞血管生成，小鼠體內過表達miR-143可有效改善骨質丟失及老年性骨質疏松[34]。BMP途徑的下游調節因子Smad 1、Smad 5、Smad 6和Smad 7可結合Smad泛素調節因子1(Smad ubiquitination regulatory factor-1，Smurf-1)誘導E3泛素連接酶依賴性蛋白降解[35]。miR-590-5p通過靶向Smad7，miR-503、miR-15b和miR-17則通過靶向Smurf-1，間接保護Runx2降解減少而促進成骨細胞分化[36-39]。Hsc70相互作用蛋白/STIP1同源性的C末端和含有蛋白1的U-Box(CHIP/STUB1)可通過促進Runx2蛋白降解而負調控成骨細胞分化，miR-764-5p則可抑制CHIP蛋白翻譯而促進成骨分化[40]。He等[41]研究發現，miR-20b可通過抑制PPARγ、Bambi和Crim1在多個階段激活BMPs/Runx2信號通路而促進成骨。miR-335-5p則可通過下調Dickkopf相關蛋白1上調β-catenin表達，激活Wnt信號通路，促進成骨分化[42]。另有一項研究表明，miR-29b對成骨分化具有正性調控作用，可直接下調已知的成骨細胞分化抑制因子HDAC4、TGF-β3和ACVR2A等，并可抑制膠原合 成，促進骨質礦化[43]。

1.3 microRNAs調 控 成 骨 細 胞 增 殖 和 凋 亡 miRNAs同時也能調控成骨細胞的增殖和凋亡[44]。研究發現，miR-17-92基因簇可促進成骨細胞增殖，抑制其凋亡[45-46]。microRNA-23a則可通過調節Fas的表達，抑制小鼠成骨細胞凋亡[47]。相反，miR-182可通過抑制FoxO1減少成骨細胞增殖，促進其凋亡[48]。Wei等[49]研究發現，miR-34b/c基因敲除小鼠模型中成骨細胞數量增加，細胞實驗進一步證實miR-34b/c通過抑制細胞周期蛋白D1積累來抑制成骨細胞的增殖。miR-542-3p的過表達則可通過抑制BMP-7及其下游PI3K/survivin通 路促進成骨細胞凋亡[19]。

2 lncRNAs調控成骨細胞功能

lncRNAs是長度超過200 nt的非編碼RNA，大多數由RNA聚合酶Ⅱ轉錄產生，具有mRNA的結構特征(5’帽式結構和3 ’polyA尾)，但沒有長閱讀框架。lncRNAs可以定位于胞核和胞質中，通過多種機制調節基因表達。定位于細胞核的lncRNAs，主要參與蛋白質編碼基因表達的轉錄調控和表觀遺傳調控等；而定位于細胞質的lncRNAs，則主要參與轉錄后基因調控過程，尤其是 與microRNAs相互調控[5]。

2.1 lncRNAs在成骨分化過程中的改變 通過高通量技術檢測發現，lncRNAs在成骨分化過程中表達發生改變。Zuo等[50]研究發現，骨髓間充質干細胞C3H10T1/2誘導分化過程中有116個差異表達的lncRNAs，并發現了24對lncRNAs和附近的mRNAs協同差異表達。Qiu等[51]在hBMSCs的成骨分化中發現433個持續上調和232個持續下調的lncRNAs。Song等[52]在MSC成骨分化過程中發現574個lncRNAs的表達發生顯著改變，其中TCONS_00046478、TCONS_00027225和TCONS_00007697可能作為miR-689、miR-544和miR-640的前體調控共表達基因(Col4A4、Col21A1和WNT2)在成骨分化中發揮作用。Wang等[53]在hBMSCs成骨分化過程中的lncRNAs微陣列分析鑒定出1 206個差異表達的lncRNAs，其中H19和uc022axw.1可能在成骨過程中起重要作用。Zhang等[54]認為MSC成骨分化過程中1 408個差異表達明顯的lncRNAs中有6個核心調控因子(NR_024031、XR_111050、FR148647、FR406817、FR401275和FR374455)，且XR_111050具有促進成骨細胞分化的潛能。Xie等[55]研究發現強直性脊柱炎患者骨髓MSC較正常人MSC具有更強的成骨分化能力，微陣列分析結果顯示有520個差異表達明顯的lncRNAs，其中lnc-ZNF354A-1、lnc-LIN54-1、lnc-FRG2C-3和lnc-USP50-2可能參與了強直性脊柱炎患者骨髓MSC的成骨分化異常。在其他類型的細胞中，如人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)、人脂肪干細胞(human adipose-derived stem cells，hASCs)和小鼠成骨細胞系MC3T3-E1中，同樣發現 成骨分化過程中lncRNAs表達的顯著差異[56-59]。

2.2 lncRNAs調控成骨細胞分化 在成骨細胞中，目前研究較多的是lncRNAs對成骨分化的調控作用[60-61]。在轉錄水平，Tang等[62]研究發現，BMSCs中lncRNA OG可與異質核核糖核蛋白K蛋白相互作用激活BMP信號通路促進成骨分化。Jin等[63]發現在hASCs中lncRNA MIR31HG可以直接與IκBα相互作用，參與NF-κB的活化。敲除MIR31HG基因不僅能顯著促進成骨分化，還能顯著緩解炎癥誘導的hASCs成骨抑制作用。在老齡化研究中發現lncRNA Bmncr可以調節BMSCs的命運。Bmncr作為促進TAZ和ABL蛋白相互作用的支架，可以促進TAZ和Runx2/pPARG轉錄復合物的組裝，進而促進成骨分化并抑制脂肪生成[64]。而在成骨相關疾病的研究中同樣發現，多發性骨髓瘤患者的hBMSCs成骨分化受到抑制，lncRNA MEG3表達降低。MEG3通過直接影響SOX2活性而激活BMP4的轉錄活性，基因敲除MEG3可顯著降低成骨標志物Runx2等的表達[65]。lncRNAs也可以在表觀遺傳水平調控成骨分化，尤其是通過組蛋白修飾影響基因表達。EZH2可以通過催化靶基因啟動子組蛋白H3K27的甲基化抑制靶基因的表達。lncRNA HoxA-AS3和lncRNA ANCR均可與EZH2結合引起H3K27甲基化，抑制MSCs中Runx2的表達，進而抑制成骨分化[66-67]。另有研究發現，lncRNAs可以通過組蛋白乙酰化修飾靶基因，如lncRNA AK141205和lncRNA-HIF1α-AS1可以分別通過促進CXCL13、HoxD10啟動子區組蛋白H4的乙酰化上調其表達，進而促進成骨細胞分化[68-69]。而在轉錄后水平，尤其是lncRNAs和microRNAs相互調控進而影響成骨細胞功能的研究目前較多也較為成熟，下 文將進行重點闡述。

2.3 lncRNAs調控成骨增殖和凋亡 lncRNAs同樣可以調節成骨細胞的增殖和凋亡。lncRNA DANCR在hBMSCs中的表達減少，可通過p38絲裂原活化蛋白激酶途徑抑制成骨細胞增殖[70]。在hPDLSCs中抑制lncRNA ANCR表達，可抑制GSK3β表達，激活Wnt通路促進其增殖[71]。在MC3T3-E1細胞中，lncRNA Crnde也可以通過Wnt通路促進成骨細胞增殖[72]。而去卵巢骨質疏大鼠成骨細胞中lncRNA AK023948表達明顯增多，通過調節AKT磷酸化水平抑制成骨細胞增殖[73]。此外，重力敏感的lncRNA ODSM在MC3T3-E1細胞 中不僅能促進成骨分化，也能抑制其凋亡[74]。

3 microRNAs和lncRNAs相互作用調控成骨細胞功能

競爭性內源性RNAs (competitive endogenous RNAs，ceRNAs)假說是一種重要的功能模式，lncRNAs可通過與miRNAs相互作用作為ceRNA調節基因表達，這類lncRNAs亦被稱為miRNA海綿[75]。這類lncRNAs包含一個或多個miRNA的結合位點，并通過吸附miRNAs減少其與靶mRNA的結合或加速其降解。反過來，miRNAs也可以與lncRNAs通過AGO2途徑結合調節1ncRNAs的表達水平。

目前研究發現microRNAs和lncRNAs可以相互作用，協同調節成骨細胞功能。研究發現，lncRNA PGC1β-OT1可以通過拮抗miR-148a-3p促進賴氨酸特異性脫甲基酶6b(KDM6B)的表達，MCF2L-AS1也可通過結合miR-33a促進Runx2表達，LOC100506178和lncRNA Rhno1可分別與miR-214-5p和miR-6 979-5p結合促進BMP2表達，進而促進BMSCs向成骨細胞分化[76-79]。Linc-ROR同樣可以通過結合miR-138和miR-145，促進ZEB2的表達，進而激活Wnt/β-catein通路，促進成骨細胞分化[80]。牙周炎患者hPDLSCs中lncRNA-POIR表達下降，與miR-182相互抑制，形成一個網絡來調節FoxO1表達，促進hPDLSCs向成骨分化[81]。在hASCs的研究中發現lncRNA-HIF1A-AS2、lncRNA-PCAT1可分別吸附miR-665和miR-45-5p，促進ASC成骨分化[82-83]。Linc02349作為miR-25-3p和miR-33b-5p的分子海綿可分別調控SMAD5和Wnt10b的表達，激活Dlx5/OSX途徑，從而促進人臍帶源性干細胞向成骨分化[84]。在MC3T3-E1細胞中發現lncRNA OGRU可通過競爭性結合miR-320促進Hoxa10蛋白表達，進而促進成骨細胞分化[85]。相反的，Yang等[86]在骨質疏松患者的骨組織中及去卵巢骨質疏松小鼠的BMSC和骨組織中觀察到lncRNA-ORLNC1表達升高。進一步研究發現lncRNA-ORLNC1可以作為ceRNA結合miR-296，影響靶基因Pten的表達，抑制成骨分化。骨質疏松患者血清中lncRNA H19表達顯著減少，體外研究發現lncRNA H19可以通過下調miR-19b-3p表達而顯著抑制BMSCs細胞增殖和成骨分化[87]。在小鼠MC3T3-E1前成骨細胞中，miR-139-3p可以抑制成骨細胞分化、促進成骨細胞凋亡，并且可以與lncRNA ODSM相互調控[88]。而lncRNA KCNQ1OT1可以與miR-701-3p相互作用，通過調控FGFR3表達促進MC3T3-E1細胞增殖、遷移，減少凋亡[89]。Bu等[90]發現lncRNA TSIX可以負性調節miR-30a-5p表達，促進成骨細胞凋亡。此外，He等[91]研究發現miR-141可以通過下調lncRNA H19和miR-675的表達，抑制成骨細胞增殖，促進成骨細胞凋亡。

lncRNAs還可作為具有miRNAs的前體分子發揮調控功能。Huang等[92]研究發現，lncRNA H19外顯子可以編碼miR-675，抑制TGF-β1的mRNA和蛋白表達，減少Smad3的磷酸化水平，進而通過下調組蛋白去乙酰化酶4/5的表達，增加成 骨標志基因Runx2等的表達，促進成骨分化。

4 結語

綜上所述，microRNAs和lncRNAs在成骨細胞中構成了復雜的相互作用網絡，可以調控成骨細胞功能，影響骨形成，對骨穩態的維持至關重要。然而目前仍有一些問題需要解決，如成骨細胞中不同microRNAs和lncRNAs相互作用的研究較少，成骨細胞眾多發揮作用的ncRNA中最為關鍵的分子尚不十分明確。進一步研究應闡明成骨細胞中microRNAs和lncRNAs的作用機制，探尋其關鍵通路和靶點，可以更好地幫助研究骨質疏松、骨發育不良等疾病的發病機制，并可能為這些疾病提供新的治療藥物。