抗衰老和抗纖維化的嵌合抗原受體T細(xì)胞

李飛 陸倫根

嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)最早于1989年由Zelig Eshhar提出，他將抗體的輕重鏈與T細(xì)胞受體(TCR)的恒定區(qū)相連，構(gòu)建出不依賴主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的嵌合T細(xì)胞受體[1]。基于該原理，他提出具有腫瘤特異性嵌合抗原受體(CAR)的T細(xì)胞可用于殺滅腫瘤細(xì)胞的設(shè)想。經(jīng)過多年發(fā)展，CAR-T技術(shù)日臻成熟，且被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤并取得了極佳的療效[2]，同時有大量研究在探索該療法用于治療實體瘤的可能性[3- 4]。該方法首先需從患者外周血中分離出T細(xì)胞，采用基因工程技術(shù)進行修飾，使其能夠表達腫瘤特異性嵌合抗原受體，并在體外大量擴增后再回輸至患者體內(nèi)，腫瘤特異性抗原受體可以特異性識別腫瘤細(xì)胞膜表面抗原并激活T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞實施免疫清除[5]。除此之外，CAR-T細(xì)胞還被嘗試用于抗衰老和抗纖維化治療等方面[6]。

細(xì)胞衰老又稱為復(fù)制性衰老，是指細(xì)胞不可逆地喪失增殖能力，進入細(xì)胞周期停滯狀態(tài)。衰老細(xì)胞可以分泌炎癥因子、趨化因子、腫瘤壞死因子、蛋白酶等衰老相關(guān)分泌表型(SASP)，這些分子能招募NK細(xì)胞和T細(xì)胞對衰老細(xì)胞進行免疫清除，參與組織重建、創(chuàng)傷愈合、免疫監(jiān)視等生物學(xué)功能，而衰老細(xì)胞的聚集可能導(dǎo)致疾病，因此清除衰老細(xì)胞有可能用于疾病治療[7]。肝星狀細(xì)胞(HSC)在肝臟受損后活化并分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),在肝纖維化和肝硬化的形成中發(fā)揮核心作用[8]。活化的星狀細(xì)胞具有極大的異質(zhì)性和各自不同的生物學(xué)特點。根據(jù)其增殖能力和分泌ECM的能力，可將HSC分為具有高增殖能力的HSC、具有較強ECM分泌能力的HSC以及衰老的HSC等三個亞群[9]。研究表明，抑制HSC或清除HSC可減少其通過自分泌、旁分泌對自身和其他細(xì)胞的作用，進而抑制肝纖維化的發(fā)生和進展[8]。

Amor等[10]研究發(fā)現(xiàn)，通過CAR-T可以靶向殺滅衰老的星狀細(xì)胞，減輕肝纖維化，改善肝功能。在該實驗中，研究人員通過RNA測序分析MEK聯(lián)合CDK4/6抑制劑誘導(dǎo)的衰老肺腺癌細(xì)胞、N-ras原癌基因誘導(dǎo)的衰老肝細(xì)胞以及體外增殖誘導(dǎo)的衰老小鼠肝星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，最終篩選出衰老細(xì)胞高表達、其他重要組織器官不表達的PLAUR作為衰老特異性基因，該基因編碼尿激酶纖溶酶原激活物受體(uPAR)，該受體表達于細(xì)胞膜表面，參與組織重建、傷口愈合以及腫瘤形成等病理生理過程，在與配體結(jié)合后酶解為可溶性uPAR(suPAR)作為SASP和衰老相關(guān)疾病的血清學(xué)標(biāo)志物[11]。免疫組織化學(xué)實驗證實，該受體表達于多種衰老細(xì)胞膜表面，包括非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌以及四氯化碳所致肝纖維化小鼠模型肝臟細(xì)胞。此外，該課題組還證實，不同病因所致人肝纖維化組織高表達uPAR，這些uPAR陽性細(xì)胞高表達SA-β半乳糖苷酶、p16以及IL-6等衰老相關(guān)分子，低表達細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67；進一步研究表明，部分uPAR陽性細(xì)胞共表達星狀細(xì)胞標(biāo)志物desmin。基于以上實驗結(jié)果，uPAR被認(rèn)為是一個具有較高特異性的衰老相關(guān)細(xì)胞膜蛋白。因此該課題組構(gòu)建了uPAR特異性小鼠CAR-T細(xì)胞，并將其分別注射至四氯化碳或高脂飲食所致肝纖維化小鼠體內(nèi)，20 d后獲取肝組織樣本，發(fā)現(xiàn)給予uPAR特異性CAR-T細(xì)胞小鼠肝臟衰老細(xì)胞顯著減少，并且肝纖維化程度明顯改善。因此，CAR-T細(xì)胞有望成為治療肝纖維化的新方法。

盡管Amor課題組發(fā)現(xiàn)uPAR特異性CAR-T細(xì)胞能減輕肝纖維化，并改善肝功能，但該治療方案仍有諸多問題需要解決。既往研究表明，衰老的星狀細(xì)胞分泌ECM的能力下降，并能分泌ECM降解相關(guān)酶；另外衰老的星狀細(xì)胞可招募多種免疫細(xì)胞，尤其是NK細(xì)胞對其進行免疫清除并能降解ECM的沉積，因此衰老的星狀細(xì)胞能通過多種機制抑制肝纖維的進展[9,12]。在Amor的研究中，CAR-T細(xì)胞清除掉uPAR陽性的衰老星狀細(xì)胞，并沒有將具有活躍增殖能力和分泌ECM的活化的星狀細(xì)胞殺滅，卻展現(xiàn)出顯著的抗纖維化效果，因此uPAR特異性CAR-T細(xì)胞減輕肝纖維化的機制有待進一步研究。uPAR并非衰老的星狀細(xì)胞特異性標(biāo)志物，且活化的星狀細(xì)胞亦不同程度表達uPAR，衰老的星狀細(xì)胞與活化的星狀細(xì)胞存在一定程度重疊，而非完全獨立的兩個亞群。此外，Amor等發(fā)現(xiàn)uPAR陽性的星狀細(xì)胞表達SA-β半乳糖苷酶和p16等衰老標(biāo)志物，但并非所有uPAR陽性的星狀細(xì)胞均表達衰老標(biāo)志物，表明并非所有uPAR陽性的星狀細(xì)胞都處于衰老狀態(tài)。另外，部分uPAR陽性細(xì)胞表達巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80，表明uPAR特異性CAR-T細(xì)胞亦可殺滅巨噬細(xì)胞，因此uPAR特異性CAR-T細(xì)胞治療肝纖維化的機制有待進一步明確。本研究僅對四氯化碳和脂肪肝所致肝纖維化小鼠模型進行描述，未對其他病因所致人肝纖維化組織uPAR的表達情況進行探索，因此需要進一步研究。在本實驗中，Amor等僅實施了單次CAR-T細(xì)胞注射治療，20 d后即獲取小鼠肝臟和血清樣本進行分析，因此無法評估其長期療效和不良反應(yīng)。另外，其他組織細(xì)胞也可低表達uPAR，而作為uPAR特異性CAR-T細(xì)胞的靶標(biāo)，CAR-T細(xì)胞對這些細(xì)胞的清除是否會產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)亦有待進一步研究。

綜上所述，衰老的星狀細(xì)胞表達膜蛋白uPAR，據(jù)此可構(gòu)建uPAR特異性CAR-T細(xì)胞對其進行免疫清除治療肝纖維化和改善肝功能。但該治療方案能否用于肝纖維化治療尚需完成以下工作：明確uPAR在星狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中的表達情況，闡明uPAR特異性CAR-T細(xì)胞緩解肝纖維化的確切機制；明確uPAR在不同病因所致人肝纖維化中的表達情況，以此判斷uPAR特異性CAR-T細(xì)胞是否能廣泛用于各種病因所致肝纖維化的治療；全面評估uPAR特異性CAR-T細(xì)胞治療肝纖維化的長期療效以及不良反應(yīng)。