尿源性干細胞神經生物學特性及神經修復的研究進展

王姣 李嵐 余昌胤△

(1.首鋼水鋼總醫院腦科中心，貴州 六盤水 55300；2.遵義醫科大學附屬醫院神經內科，貴州 遵義 563003)

1 hUSCs的神經生物學特性

1.1hUSCs的來源及特征 尿液獲取hUSCs具備非侵入性、無限性，多項研究發現尿液中可提取出USCs，但實驗中各方面原因導致所獲得的USCs計數約有差異。有研究發現人體24 h內泌尿系統中大約有6×104個細胞的更替[1]。Bharadwaj等[2]從上尿路尿液標本中獲得的USC，發現每個USCs克隆30 d內在第5代(P5)時產生約4×108個細胞，其實驗數據顯示上尿路的尿液1 mL尿含有約1.4+0.7個USCs克隆。Lang等[1]通過對保存24 h的尿液標本所獲得的USCs與新鮮尿液標本所獲USCs進行比較研究，發現在每100 ml尿液樣本中，保存24 h的尿液中有3～4個USCs克隆、12 h的尿液中有4～5個克隆、新鮮尿液中有6～7個克隆。實驗中Lang等人從新鮮和24 h保存的尿液標本(保存在含有0.5%血清和10%血清的USC培養基中)收集了30個USC克隆(每組10個)進行端粒酶活性檢測，發現半數(5/10)保存細胞克隆具有較高的端粒酶活性，而(4/10)新鮮USCs具有端粒酶活性，均為正常核型。也有研究表明[3]，75%以上的中老年個體端粒酶活性(USC-TA+)表達，并保留長端粒長度，但在50歲或50歲以上的hUSCs的USCs-TA+下降到50%～60%。近年來，隨著基于干細胞研究的快速發展，干細胞的多項分化特性，目前多項研究[4-6]證實在特定的培養基中可培養出連續傳代且核型穩定的hUSCs，并在融合率80%左右的第4代hUSCs分別加入成脂、成骨、成神經誘導培養液后，誘導12 d、14 d、21 d后經染色鑒定后可證實hUSCs可成功分化為成脂細胞、成骨細胞、神經細胞。

1.2hUSCs的神經分化條件 2008年張元原教授[7]首次成功地分離培養出三種不同形態的表現為完全分化、分化、祖細胞樣細胞的細胞，證實了只有紡錘體外觀的小細胞類型被命名為人尿源性干細胞(hUSCs)，將提取出的hUSCs通過流式細胞術檢測其表面標志物(SSEA 4、CD 105、CD 73、CD 90和CD 44)呈陽性，說明hUSCs具有間充質干細胞相似特性。hUSCs一旦被分離后，可在體外連續擴增，并在不同的實驗條件下加入不同的生長因子和細胞外基質(ECM)后通過特異性誘導分化為多種細胞類型，通過在補充堿性成纖維細胞生長因子的神經誘導培養基中培養USCs，獲得神經元細胞[8]。研究表明層粘連蛋白和PDGF-bb參與神經元的生長和分化[9]，神經元祖細胞在PDGF-BB刺激后，可使miR-9(microRNA-9)表達增加，而PDGF-bb介導的mir-9/MCPIP1通過抑制miR-9靶點MCPIP1(monocyte chemotactic protein-induced protein 1 )調節神經祖細胞的增殖、分化和遷移[10]，表明調節miR-9/mcp 1軸的治療策略的制定可以被認為是一個涉及促使神經發生受損的各種神經退行性疾病的治療潛在的靶點。故Kim JY[9]等將hUSCs在神經元分化培養基中分別及共同加入層粘連蛋白和PDGF-bb誘導神經元分化，培養14 d后，hUSCs表現為神經元樣形態改變，包括錐體細胞體、軸突樣結構和樹突，在上述所有3種誘導條件下均能觀察到神經元樣細胞，其中神經元分化培養基(DM)+層粘連蛋白+PDGF-bb處理組神經元細胞最多。提示層粘連蛋白和PDGF-bb可刺激hUSCs向神經元細胞分化。Chun等[10]研究指出hUSCs體外培養時在I型膠原和缺氧條件下可刺激細胞增殖，保留干細胞特性，但分化受到抑制。

1.3hUSCs自身表達神經細胞特異性蛋白 Jung Yeon Kim等[9]應用實時PCR分析及流式細胞術檢測證實hUSCs可表達神經元標記蛋白巣蛋白(Neuroepithelial stem cell protein，Nestin)、微管相關蛋白2(Microtubule-associated protein 2，MAP-2)、微管蛋白β(β-Tubulin-Ⅲ)、神經絲蛋白(Neurofilamentprotein，NF-M)和神經元特異性核蛋白(Neuron specific nuclear protein，NeuN)，并用免疫細胞化學染色檢測到hUSCs表達Nestin、MAP-2、β-Tubulin-Ⅲ和NF-M等神經元標記蛋白。而且，在神經誘導培養基誘導后檢測到SOX2和Nestin陽性細胞數顯著增加，且在RT-PCR基因表達分析表明，神經元祖細胞標記Nestin和SOX2顯著增加[5-6]，而成熟神經元標記β-Tubulin-Ⅲ未被上調[5]，提示hUSCs可分化為神經祖細胞。約40%的誘導細胞表達多種神經標記物，如Nestin、S100、NF 200和GFAP，在體外和體內均表現出神經源性的延伸和突起[5]。龔飛翔[6]通過q-PCR檢測比較hUSCs經神經誘導培養7 d和12 d后的神經標志物的表達量，發現12 d后SOX2(神經祖細胞標志物)和GFAP(神經膠質細胞標志物)的表達上調，而NSE和MAP-2(成熟神經元標志物)的表達下調，同時，細胞免疫熒光檢測結果顯示hUSCs經神經誘導前未見明顯Nestin和SOX2陽性細胞，誘導后7 d和12 d其表達量明顯增加，且在12 d時仍在繼續增加。上述研究均提示hUSCs具有分化為與神經元相似的神經生物學特性。

1.4hUSCs神經營養作用 多項體內外研究發現，各種細胞生長因子及神經營養因子在神經細胞存活、增殖及分化調節中具有至關重要的作用，這些生長因子主要包括：表皮生長因子家族(Epidermal growth factor，EGF)、成纖維細胞生長因子家族(Fibroblast growth factor，FGF)、胰島素樣生長因子(Leucocyte inhibitory factor，IGF)、腦源神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神經生長因子(Nerve growth factor，NGF)，膠質細胞源性神經營養因子(Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)等；這些細胞因子可誘導干細胞向神經元定向分化。堿性成纖維生長因子( Basic fibrolast growth factor, bFGF) 是廣泛存在于干細胞中的一種多肽物質，是酪氨酸激酶的胞外配體，具有傳遞發育信號和修復組織的作用，同時可調控神經細胞增殖分化過程，Perez-Ilzarb等[11]通過探討比較人骨髓間充質干細胞(hMSCs)的體外擴增培養條件時發現高濃度的bFGF可明顯促進hMSCs增殖，而低濃度bFGF則可誘導hMSCs向神經細胞的定向分化。故實驗中在無血清誘導培養基中加入bFGF、EGF可有效地使hUSCs穩定增殖且不影響神經元標志物的表達。hUSCs在良好的微環境下可分泌細胞因子，最近，有研究發現生長因子(VEGF、IGF-1、FGF-1、PDGF、HGF和NGF)從海藻酸鈉微球中局部釋放出來[12]，誘導hUSCs的功能分化，增強血管再生及神經支配，并刺激體內駐留細胞的生長。表明hUSCs與其他干細胞一樣具有神經營養作用。

1.5hUSCs外泌體 外泌體(Exo)屬于細胞外囊泡(EV)的一種，是由細胞膜內陷形成胞內小泡，小泡膜經過胞漿內各種酶類的修飾、轉運、融合，最后通過胞吐的方式排到胞外。外泌體包含有mRNA、miRNA及蛋白質等多種小分子的小囊泡。幾乎所有細胞均可產生外泌體，有研究證實[13]Exo還包含有HGF、BDNF、VEGF、ICF、NGF，且ICF、HGF含量較高，推測這兩鐘細胞因子可能對神經損傷有保護作用，并且其保護作用可能是通過凝脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路實現的。Jiang等[14]通過超濾組合純化方法分離來自尿源干細胞條件培養基中的外泌體(USCs-Exo)，并在透射電子顯微鏡(TEM)下可以看到USCs-Exo是約100 nm的球形囊泡，可調電阻脈沖傳感(TRPS)分析顯示USCs-Exo的大小約為50-100 nm，與TEM一致。Western印跡顯示USCs-Exo中表達CD9，CD63和CD81等外泌體標記物，該研究進一步進行酶聯免疫吸附試驗(ELISA)證實了USCs-Exo含有促進血管生成及細胞存活的細胞因子包括足細胞存活因子(BMP-7)和血管生成相關蛋白(VEGF，TGF-β1和血管生成素)。上述研究提示外泌體可能是神經保護作用或治療中的關鍵組件。

2 hUSCs對中樞神經系統損傷的應用

hUSCs是近年來發現的新型干細胞，有研究證實hUSCs在替換衰老、受損細胞方面以及促進器官組織再生方面均發揮著重要作用。而且以前有研究證實MSCs免疫原標記HLA-DR(II類MHC)在極少(<3%)的細胞中表達，說明免疫排斥反應較低[15]，且應用免疫細胞化學檢測未發現HLA-DR(II類MHC)表達增強[16]。hUSC與MSCs具有相似特性，其移植后也可能無排斥而具有良好的安全性，提示hUSC可作為細胞移植治療的潛在細胞。

Guan等[5]首次探討hUSC應用于神經元再生的治療，實驗通過與ASCs比較，證明hUSC與ASCs具有相識的生物學特性，可在體外分化為神經細胞，該實驗進一步用綠色熒光蛋白(GFP)轉染第4代USCs，然后將GFP標記的hUSC(GFP-hUSC陽性細胞)種植在BeaverNano水凝膠支架上，在腦損傷后的8周齡SD大鼠病變部位注射含有1×106GFP-hUSC的100ml水凝膠，移植3周后，可見GFP陽性細胞聚集在病灶周圍區域，而在海馬區也發現GFP陽性細胞，通過檢測發現移植的GFP陽性細胞也能表達β-Tubulin-Ⅲ、GFAP和Nestin等神經分化標記物，說明hUSC大鼠腦內具有生存、遷移及神經分化能力。龔飛翔[6]將hUSCs通過慢病毒轉染標記GFP后移植到腦損傷模型大鼠腦內，發現移植1W、3W后均可見GFP-hUSCs陽性細胞從腦損傷區遷移至海馬區，并且在海馬區分別在移植1W后檢測到Nestin陽性細胞及移植3W后檢測到β-Tubulin-Ⅲ、GFAP陽性細胞，證實了hUSCs腦內移植后的存活、遷移以及分化能力，表明hUSC是具有中樞神經系統損傷后功能修復的潛在細胞。

3 展 望

hUSCs是近年來發現的從尿液中分離提取的一種新型干細胞。目前，研究發現在實驗性腦卒中模型中移植骨髓間充質干細胞(MSC)可減少神經元損傷和梗塞體積，增加血管生成和神經發生，改善神經功能。由于其在臨床前模型中的有益作用，已開始使用MSCs進行對照隨機臨床試驗以治療腦卒中，最長觀察5年沒有發現臨床相關的副作用[17]。由于干細胞及祖細胞均能分泌因子(外泌體)促進腦缺血后神經功能的恢復，DOEPPNER團隊[18]將MSC-EV和MSC移植到短暫局灶性腦缺血模型小鼠，研究結果顯示，MSC-EV與MSC均能有效地改善神經損傷，并誘導與增強的血管神經發生相關的長期神經保護作用，且兩者效果相似，因此他們認為EV是MSCs促進卒中后恢復的關鍵組成部分。hUSCs無侵入性、易獲取，具有干細胞的生物學特性，目前僅有為數不多的研究將hUSCs用于中樞神經系統損傷，但在腦缺血、神經系統變性及退行性疾病等相關研究值得進一步深入探討。