紅參中總皂苷及人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量的測定

劉春霖，謝強勝，李啟艷，高天陽，劉慧香，蔣慧

(山東省食品藥品檢驗研究院,山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心，山東 濟南 250101)

紅參為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey. )的栽培品經蒸制后的干燥根和根莖。具有大補元氣，復脈固脫，益氣攝血的功能[1]。現代科學研究表明，紅參可以提高人體免疫力、抗疲勞、抗衰老、抑制腫瘤、調節神經、心血管及人體內分泌系統等功效[2-7]。紅參中含有的成分很多，人參皂苷類成分是其主要藥理活性成分。紅參是將鮮參或生曬參經高溫蒸制干燥而得，鮮參中的皂苷類成分會發生糖苷鍵和酯鍵的斷裂，生成某些特有皂苷[8]，主要體現在較大極性人參皂苷的脫糖基轉化以及人參皂苷C-17位側鏈的變化[9-11]。紅參中特有的皂苷組分所含糖鏈更少，極性更低，更有利于人體腸道吸收。因此，人參皂苷是衡量紅參質量優劣的重要指標。

人參皂苷的主要分析方法有高效液相色譜法(HPLC)、比色法(UV)、薄層色譜法(TLC)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)等[12]。其中高效液相色譜法和比色法為常用的人參皂苷測定方法，高效液相色譜法適合單體人參皂苷含量的測定，比色法適合人參總皂苷含量的測定[13]。因此，本文以皂苷類成分為測定指標，采用紫外可見分光光度法、高效液相色譜法，分別對紅參中總皂苷及人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量進行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Mettler Toledo Ms十萬分之一電子天平(德國梅特勒公司)；TU-1901紫外分光光度計(北京普析通用公司)；島津LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-500DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司)。

1.2 試劑試藥 甲醇、乙腈，色譜純；磷酸、正丁醇、三氯甲烷、乙醇、高氯酸、冰乙酸，分析純；水為超純水；5%香草醛溶液：稱取5 g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100 mL。

對照品：人參皂苷Re(含量測定用，中國食品藥品檢定研究院，批號110754-201626，純度97.4%)；人參皂苷Rg1(含量測定用，中國食品藥品檢定研究院，批號：110703-201832，純度92.4%)；人參皂苷Rb1(含量測定用，中國食品藥品檢定研究院，批號：110704-201424，純度93.7%)。

紅參藥材：吉林省20批，遼寧省4批，黑龍江省2批，均經山東中醫藥大學田景振教授鑒定為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的栽培品經蒸制后的干燥根和根莖。

2 方法與結果

2.1 紅參中總皂苷含量的測定方法 精密稱取紅參樣品粉末適量(過四號篩，稱樣量根據總皂苷含量定)，置100 mL容量瓶中，加少量水，超聲15 min，再用水定容至100 mL，搖勻，放置，吸取上清液1.0 mL進行柱層析。取層析柱，內裝3 cm D-101大孔吸附樹脂，上加1 cm中性氧化鋁。先用25 mL 70%乙醇洗柱，棄去洗脫液，再用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，精確加入1.0 mL上述已處理好的樣品溶液，用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，再用25 mL 70%乙醇洗脫總皂苷，收集洗脫液于蒸發皿中，置于60 ℃水浴揮干，以此作顯色用。在上述已揮干的蒸發皿中準確加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，轉動蒸發皿，使殘渣溶解，再加入0.8 mL高氯酸，混勻后移入10 mL帶塞刻度離心管中，60 ℃水浴上加熱10 min，取出，冰浴冷卻后，準確加入冰乙酸5.0 mL，搖勻后，以1 cm比色皿于560 nm波長處與標準管一起進行比色。

2.1.1 對照品溶液制備及線性關系考察 精確稱取人參皂苷Re對照品17.92 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即每1 mL含人參皂苷Re 1.745 mg。吸取上述人參皂苷Re標準溶液25、50、75、100、125 μL置蒸發皿中，于60 ℃水浴揮干，加水適量溶解殘渣，以下操作從“柱層析”起，與樣品相同，測定吸光度值。以濃度(μg)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：Y=0.00428X-0.01892，相關系數r=0.999 7。結果表明，人參皂苷Re在43.62～218.1 μg范圍內線性關系良好。

2.1.2 精密度試驗 取標準曲線第3點顯色后的溶液，連續測定6次吸光度，計算平均吸光度為0.553，RSD為0.093%。結果表明，精密度良好。

2.1.3 加樣回收率試驗 精密稱取6份樣品(編號：1)，每份約0.125 g，分別精密加入人參皂苷Re標準溶液(1.745 mg·mL-1)1.5 mL，按上述試驗方法進行處理，測定吸光度，計算平均回收率為92.5%，RSD為2.6%。結果表明，回收率良好。

2.1.4 重復性試驗 精密稱取6份樣品(編號：1)，每份約0.25 g。按上述試驗方法進行處理，測定吸光度，計算總皂苷平均含量為2.20%，RSD為2.0%。結果表明，重復性良好。

2.1.5 檢出限 參照GB/T 5009.1-2003《食品衛生檢驗方法 理化部分 總則》中附錄A.2.2規定，檢出限為3倍空白值的標準偏差(測定次數n≥20)相對應的質量，吸光法按國際理論與應用化學家聯合(IUPAC)規定。檢出限按下式進行計算：檢出限=Ks/b；b—標準曲線回歸方程中的斜率；s—20次空白值的標準偏差；K—一般為3。計算檢出限為2.4 μg。

2.1.6 樣品測定 按上述試驗方法，對26批不同產地的紅參樣品中總皂苷含量進行測定。結果顯示，總皂苷含量為1.2%～3.0%，說明不同產地紅參的總皂苷含量存在差異，這與文獻報道結果基本一致。具體結果見表1。

表1 紅參藥材總皂苷測定結果

方法學驗證試驗表明，紫外可見分光光度法測定紅參中總皂苷的方法精密度好，重現性高，方法專屬性強。

2.2 紅參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量的測定 方法：取紅參樣品粉末(過四號篩)約l g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入100 mL錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過夜，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液25 mL，置蒸發皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo Hypersil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：203 nm；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣體積：10 μL；乙腈為流動相A，水為流動相B，按下表進行梯度洗脫。

表2 梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液制備及線性關系考察 取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg1、Re、Rb1各1 000 μg的混合標準溶液。分別精密量取混合標準溶液0.1、0.4、1、2、5、10 mL加甲醇定容到10 mL，制備標準曲線，即得。按上述色譜條件，注入液相色譜儀，測得峰面積。以峰面積為縱坐標，對照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程分別是：人參皂苷Rg1為Y=3 945.08X+1 099.92，相關系數r=0.999 9；人參皂苷Re為Y=3 312.86X-1 659.22，相關系數r=0.999 9；人參皂苷Rb1為Y=2 753.65X+3 564.87，相關系數r=0.999 9。結果表明，人參皂苷Rg1在8.574 7～857.47 μg·mL-1，人參皂苷Re在10.393～1 039.3 μg·mL-1，人參皂苷Rb1在9.754 2～975.42 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.2.3 精密度試驗 取每1 mL含人參皂苷Rg1、Re、Rb1各0.2 mg的混合標準溶液，按上述色譜條件重復進樣6次，計算平均峰面積，分別是人參皂苷Rg1為645 177，RSD為0.53%；人參皂苷Re為652 791，RSD為0.61%；人參皂苷Rb1為516 661，RSD為0.60%。結果表明，精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗 取混合標準溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，計算平均峰面積，分別是人參皂苷Rg1為685 611，RSD為0.24%；人參皂苷Re為693 030，RSD為0.31%；人參皂苷Rb1為546 901，RSD為0.18%。結果表明，各組分在24 h內穩定。

2.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一編號紅參樣品9份，每份約0.5 g，低、中、高濃度水平各3份。分別精密加入人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品適量，按上述試驗方法和色譜條件測定峰面積，計算平均回收率，分別是人參皂苷Rg1為101.3%，RSD為0.46%；人參皂苷Re為102.0%，RSD為1.3%；人參皂苷Rb1為98.9%，RSD為1.4%。結果表明，各組分回收率良好。

2.2.6 重復性試驗 精密稱取同一編號紅參樣品6份，每份約1 g。按上述試驗方法和色譜條件測定峰面積，計算平均含量，分別是人參皂苷Rg1為0.314%，RSD為0.57%；人參皂苷Re為0.155%，RSD為0.48%；人參皂苷Rb1為0.501%，RSD為0.53%。結果表明，重復性良好。

2.2.7 樣品測定 按上述試驗方法，對26批不同產地的紅參樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量進行測定。結果顯示，人參皂苷Rg1、Re總量在0.17%～0.61%，人參皂苷Rb1含量在0.21%～0.81%，說明不同產地紅參的3種人參皂苷含量存在差異，這與文獻報道結果基本一致。具體結果見表3。

表3 紅參藥材3種人參皂苷測定結果

方法學驗證試驗表明，高效液相色譜法測定紅參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1方法精密度好，重現性高，方法專屬性強。

3 討論

3.1 《中國藥典》2015年版(一部)紅參規定，本品按干燥品計算，含人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總和不得少于0.25%，人參皂苷Rb1不得少于0.20%。本文26批紅參藥材中有1批含量低于限值規定，合格率為96.2%。所測結果最大比值為3.9倍，顯示含量差異較大，這可能與紅參的產地、參齡、加工炮制等有關，需要進一步加以研究。

3.2 GB/T 22538-2018《紅參分等質量》規定，本品按干燥品計算，人參總皂苷≥2.00%。本文26批紅參藥材中有11批含量低于限值規定，合格率為57.7%。合格率較低的原因可能是不同產地的紅參藥材本身質量存在差異；另外總皂苷沒有統一的國標檢測方法，不同檢測方法也可能導致結果的差異。GB/T 22538-2018《紅參分等質量》非強制性國家標準，而《中國藥典》2015年版(一部)紅參未規定總皂苷指標。建議對紅參中總皂苷指標加以控制，能更加全面客觀地反應紅參的內在質量。

3.3 本文26批紅參藥材中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量之和與總皂苷含量的比值為0.32～0.57，平均比值為0.45，結果顯示，這3種單體人參皂苷在紅參皂苷類成分中只占一部分。紅參中除了與鮮參、生曬參共有的皂苷成分(如人參皂苷Ro、Rc、Rd、Rf等)外，還含有一些特有皂苷成分(如人參皂苷Rh1、Rh2、Rg3、Rg5、Rg6等)，需要進一步的研究。