交聯透明質酸鈉凝膠重金屬總量檢測方法比較與探討

劉葉，彭健，趙長帥，孫興霞，亓曉慶

(山東省醫療器械產品質量檢驗中心，山東 濟南 250101)

交聯透明質酸鈉凝膠是基于透明質酸鈉凝膠優異的黏彈性、保濕性、生物相容性、可降解性等性能特性，通過添加一種或多種組合的化學交聯劑而獲得[1-4]。交聯透明質酸鈉凝膠更好的機械支撐性能和抗降解性能，同時也保留透明質酸鈉凝膠良好的生物相容性，非免疫原性等優勢，被廣泛應用于組織工程、醫療美容領域(除皺、塑性以及面部年輕化等治療)[5-6]。據統計，全球透明質酸填充劑市場將以年復合增長率12%的速度，從2016 年的17億美元增長到2020年的27億美元[7]。

作為植入人體并在人體內存在較長時間的特殊醫療器械產品，交聯透明質酸鈉凝膠在其原料生產過程和交聯過程中都有可能引入各種對人體有害的微量重金屬[8-9]，因此交聯透明質酸鈉凝膠中重金屬限量檢測是一項有重要安全意義的基礎檢測。目前我國醫藥行業對產品中重金屬限量的相關檢測主要依據《中國藥典》[10]進行，《中國藥典》2015年版0821重金屬檢測法共3個檢測方法，第一法(硫代乙酰胺法)適用于供試品可不經過有機破壞，在酸性溶液中顯色的重金屬限量檢查；第二法(熾灼殘渣法)是將供試品熾灼破壞后，加硝酸、硫酸加熱處理，使有機物分解、破壞完全后，再按硫代乙酰胺法進行檢查，適用于在水、乙醇中難溶解的供試品的重金屬限量檢查；第三法(硫化鈉法)適用于供試品能溶于堿而不溶于酸(或在稀酸中生成沉淀)的重金屬限量檢查。本試驗綜合考慮市售和在檢作為醫療器械產品使用的交聯透明質酸鈉凝膠情況，選取兩類具有代表性的非含藥交聯透明質酸鈉凝膠產品和含藥交聯透明質酸鈉凝膠產品按照第三法(硫化鈉法)和第二法(熾灼殘渣法)進行重金屬限量檢測，追蹤實驗過程并進行實驗結果分析。

1 試驗部分

1.1 標準溶液和試劑配制

1.1.1 標準鉛溶液的制備 鉛標準貯備液：稱取硝酸鉛0.159 9 g ,置1 000 mL量瓶中，加硝酸5 mL與水50 mL溶解后，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL相當于100 μg 的Pb2+)。

鉛標準溶液：精密量取貯備液10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL相當于10 μg 的Pb2+)。本液僅供當日使用。配制與貯存用的玻璃容器均不得含鉛。

1.1.2 試劑配制 氫氧化鈉試液、硫化鈉試液、乙酸鹽緩沖液(pH 3.5)、 硫代乙酰胺試液、酚酞指示劑、氨試液均按照《中國藥典》2015年版配制。硝酸、硫酸、鹽酸均為分析純試劑。

1.2 樣品 樣品A 注射用交聯透明質酸鈉凝膠 重金屬總量(以Pb2+計)：應不大于5 μg·g-1。

樣品B 含利多卡因注射用交聯透明質酸鈉凝膠 重金屬總量(以Pb2+計)：應不大于5 μg·g-1。

1.3 試驗器具及設備 電子天平、25 mL納氏比色管、移液管、坩堝、電熱爐、馬弗爐、水浴鍋。

1.4 試驗方法

1.4.1 精確稱取樣品A 2.00 g置于1號管，樣品B 2.00 g置于2號管，精確移取鉛標準溶液1 mL置于3號管中，3個納氏比色管中分別加氫氧化鈉試液5 mL，再分別加水至25 mL，搖勻，3管中分別加硫化鈉試液5滴，搖勻，置白紙上，自上向下透視，比較顏色深淺。

1.4.2 等待“1.4.1”項下反應完成后，過濾1號管與2號管中的試驗液，截留凝膠顆粒，將凝膠顆粒分別轉移至4號管和5號管，2個納氏比色管中分別加入鉛標準溶液1 mL，同時移取鉛標準溶液1 mL置于6號管作為對照管，3個納氏比色管中分別加氫氧化鈉試液5 mL，再分別加水至25 mL，搖勻，3個納氏比色管中分別加硫化鈉試液5滴，搖勻，置白紙上，自上向下透視，比較顏色深淺。

1.4.3 精確稱取樣品A 2.00 g置于1號坩堝，樣品B 2.00 g置于2號坩堝，緩緩熾灼至完全炭化，放冷，加硫酸0.5 mL，使恰濕潤，用低溫加熱至硫酸除盡后，加硝酸0.5 mL，蒸干，至氧化氮蒸氣除盡后，放冷，在550 ℃熾灼使完全灰化，放冷，加鹽酸2 mL，置水浴上蒸干后加水15 mL，滴加氨試液至對酚酞指示液顯微粉紅色，再加醋酸鹽緩沖液(pH 3.5)2 mL,微熱溶解后，移置納氏比色管中，加水稀釋成25 mL分別作為7號管和8號管；將加入相同量硝酸和鹽酸的另一瓷坩堝置于水浴上使之蒸干后，另取一納氏比色管加醋酸鹽緩沖液(pH 3.5)2 mL與水15 mL,加標準鉛溶液1 mL(每1 mL相當于10 μg 的Pb2+)，再用水稀釋成25 mL，作為9號管；再在三管中分別加硫代乙酰胺試液各2 mL，搖勻，放置2 min，同置白紙上，自上向下透視，進行比色。

2 試驗結果

表1 試驗結果匯總表

3 結果分析

通過以上試驗現象和產品本身特性有幾個部分值的討論：

圖1 交聯透明質酸鈉凝膠顆粒溶解情況(左1號管、右2號管)

3.1 目前對交聯透明質酸鈉凝膠重金屬限量的檢測，大多依據《YY/T 0962-2014 整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠》要求[11]，而《YY/T 0962-2014整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠》中對于重金屬限量檢測規定按照《中國藥典》2015年版0821重金屬檢測法中第三法進行，如試驗“1.4.1”項下所示，交聯透明質酸鈉為非水溶產品，加入氫氧化鈉試液、水、硫化鈉試液后，仍不會溶解，懸浮于水中，肉眼可見小顆粒，又由于其密度大于水，隨著時間的推移交聯透明質酸鈉顆粒會沉積在納氏比色管底部，形成明顯分層，晃動納氏比色管又會形成懸浮于水中的肉眼可見小顆粒，因此無法達到完全的均一溶液進行目視比色。

3.2 交聯透明質酸鈉凝膠是由透明質酸原料加入一種或多種組合的化學交聯劑等經過一系列反應形成的最終產物，按照“1.4.1”項下試驗方法進行試驗時，樣品未解交聯進行檢測時，原理上硫化鈉試液只能和未交聯的透明質酸鈉以及緩沖鹽體系中的重金屬進行反應，而凝膠顆粒內部所含的重金屬無法與顯色劑反應，實際上“1.4.1”項下試驗未能體現樣品的重金屬總含量的檢測目的。

3.3 如試驗“1.4.2”項下方法所進行，通過過濾已經完全反應的未交聯的透明質酸鈉凝膠以及緩沖鹽體系中的重金屬，截留交聯透明質酸鈉凝膠顆粒，通過加入一定量的重金屬標準溶液考察交聯透明質酸鈉凝膠顆粒對重金屬顯色反應的影響，加標試驗顯示由于交聯透明質酸鈉顆粒的存在會產生散射作用，使鉛標準溶液與硫化鈉的顯色反應所呈現的顏色比正常狀態下兩者的顯色反應所呈現的顏色淺，試驗說明由于交聯透明質酸鈉凝膠顆粒的存在致使反應體系不能正確體現產品中的重金屬總含量的真實情況。

3.4 試驗“1.4.3”項下通過消化處理交聯透明質酸鈉凝膠，能全面考察產品中重金屬總量，既包括產品中游離透明質酸鈉凝膠、緩沖鹽體系以及交聯透明質酸鈉凝膠顆粒內的總金屬，又能避免交聯透明質酸鈉凝膠顆粒對顯色反應的影響，在對含有鹽酸利多卡因的交聯透明質酸鈉進行檢驗時，通過消化處理后，藥物也不會對該試驗造成影響，說明熾灼殘渣法試驗適用性強，并且整個試驗安全可控，建議企業可參考該方法進行技術要求規定，以便更好地進行產品檢測。