復方丹皮酚納米乳對裸鼠體內人源肺癌 A549 的影響

劉瑾，楊宗統，隋在云，楊青

(山東省中醫藥研究院中藥藥效評價重點實驗室，山東 濟南 250014)

肺癌是目前發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]，分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC患者占85%以上[2]，大部分肺癌患者首診時已處于中晚期[3]，無法通過手術根治，化療、放療仍是NSCLC 的主要治療手段，由于藥物的毒副作用大且費用高，難以達到理想的治療效果。因此尋找一種對腫瘤細胞有高效的殺傷或抑制作用，而對正常細胞無毒性或有保護作用的治療藥物顯得尤為重要。現代醫學研究表明中醫藥在治療肺癌方面有諸多優勢，特別是中藥復方，具有多環節、多靶點、多層面防治癌癥的特點，并且毒性小，副作用低，可有效改善臨床癥狀，提高患者的生活質量，延長生存期[4-5]。本課題組以納米乳給藥系統為載體，通過最佳配伍篩選，將脂溶性丹皮酚和水溶性靈芝多糖作為有效成分制成復方丹皮酚納米乳，前期研究發現其既有抗腫瘤作用，又有增強免疫作用，可抑制A549細胞的增殖，誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡[6]。本文通過建立人源肺癌 A549裸鼠移植瘤模型，給予不同劑量的復方丹皮酚納米乳進行治療，探討復方丹皮酚納米乳對該肺癌模型的影響，并通過檢測裸鼠血清白細胞介素2(IL-2)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達水平初步探討其體內抗腫瘤機制，以期為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物、細胞株與飼料 BALB/c Nude裸鼠60只，4周齡，體重10～16 g，雌雄各半，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物質量合格證號：SCXK(京)2016-0006。人非小細胞肺癌細胞株(A549細胞)，購自國家實驗細胞資源共享平臺。SPF大小鼠生長繁殖飼料，北京科澳協力飼料有限公司，批號：18033313。

1.2 藥物與試劑 復方丹皮酚納米乳(丹皮酚的平均含量為7.612 g·L-1，靈芝多糖的平均含量為6.127 g·L-1)，山東省中醫藥研究院制劑室提供。康萊特注射液，浙江康萊特藥業有限公司，批號：1706247-2，規格：100 mL∶10 g。BD Matrigel基質膠(高濃度，康寧公司)、RPMI-1640培養液(美國Hyclone)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)、四甲基偶氮唑藍(MTT,Amresco公司)。小鼠IL-2高敏ELISA試劑盒和小鼠TNF-α高效ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術有限公司)。

1.3 儀器 SW-CJ-2FD超凈工作臺(AITTECH公司)；BDS200-PH倒置顯微鏡(奧特光學公司)；IL-16CI二氧化碳培養箱(STIK公司)；細胞計數板(上海光學儀器設備廠)；FA1204B電子天平(上海精科天美科學儀器有限公司)；離心機(美國BECKMAN公司)；xMark酶標儀(美國BIO-RAD公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 A549裸鼠移植瘤模型的建立 人非小細胞肺癌A549細胞，在37 ℃，5%CO2、飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清、1%雙抗的1640培養基傳代培養，將細胞培養到對數生長期，胰酶消化，PBS 清洗，離心收集，用生理鹽水調整細胞濃度至2×107個/mL，按照1∶1的比例加入BD Matrigel基質膠，每只裸鼠右側腋窩皮下注射0.2 mL。進出針的方式為45度斜刺入皮下，與皮膚平行約 1 cm 距離，再進入腋窩。注射結束后，為防止液體溢出，用無菌棉球按壓出針處5 s，所有裸鼠接種在0.5 h內完成。預留10只裸鼠作為正常對照組。接種后逐日觀察移植瘤的生長情況，待移植瘤體積大于100 mm3，移植瘤模型建立完成。

1.4.2 動物分組與給藥 于移植瘤體積達100 mm3以上時，將造模成功裸鼠隨機分成荷瘤對照組、康萊特注射液14 mL·kg-1(1 400 mg· kg-1)組、復方丹皮酚納米乳48、96、192 mg·kg-1劑量組。康萊特注射液組腹腔注射給予康蘭特注射液0.14 mL/10 g，復方丹皮酚納米乳各劑量組腹腔注射等體積藥物，正常對照組與荷瘤對照組腹腔注射等體積生理鹽水。每天1次，連續給藥15 d。

1.4.3 觀察指標

1.4.3.1 裸鼠一般情況觀察 每天觀察裸鼠精神、活動、飲食等一般情況。

1.4.3.2 腫瘤體積測定及質量測定 從給藥當天開始，每5 d 稱量并記錄裸鼠體質量，并用游標卡尺測量移植瘤的最大直徑(a)和最小直徑(b)，計算腫瘤體積(V=a×b2/2)，繪制移植瘤的生長曲線。治療結束后，頸椎脫臼處死裸鼠，完整剝離腫瘤組織，電子天平稱腫瘤質量，并計算抑瘤率[抑瘤率=(對照組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量)/對照組平均瘤質量×100%]。

1.4.3.3 血清IL-2、TNF-α含量測定 治療結束后，禁食不禁水12 h，摘眼球取血，3 000 r·min-1離心15 min，分離血清，按ELISA檢測試劑盒操作說明測定450 nm最大吸收波長和570 nm參考波長下的OD值，校準后的OD值為450 nm的測定值減去570 nm的測定值，并根據所配制的標準曲線計算樣本中IL-2和TNF-α 的含量。

2 結果

2.1 復方丹皮酚納米乳對人肺癌A549裸鼠移植瘤生長的影響 治療過程中各組裸鼠飲食、行為和精神狀態均未見明顯異常，各給藥組裸鼠體質量與正常對照組和荷瘤對照組相比也未見明顯差異。由表1結果可見，實驗期間各組裸鼠移植瘤體積均不同程度的增長，其中荷瘤對照組移植瘤生長迅速，復方丹皮酚納米乳各組及康萊特注射液組移植瘤生長相對緩慢；與荷瘤對照組比較，復方丹皮酚納米乳高劑量組藥后5、10、15 d腫瘤體積明顯減小(P<0.05、P<0.05、P<0.01)，康萊特注射液組藥后10、15 d腫瘤體積明顯減小(P<0.05、P<0.01)。由表2結果可見，復方丹皮酚納米乳各劑量組及康萊特注射液組裸鼠腫瘤質量比荷瘤對照組均有所降低，復方丹皮酚納米乳高劑量組和康萊特注射液組腫瘤質量較荷瘤對照組明顯減輕(P<0.05、P<0.01)，抑瘤率分別達32.95%和34.19%。以上實驗結果說明，復方丹皮酚納米乳在體內能夠抑制人肺癌A549裸鼠移植瘤的生長，具有一定的抗腫瘤作用。

表1 復方丹皮酚納米乳對人肺癌A549裸鼠腫瘤體積的影響

表2 復方丹皮酚納米乳對人肺癌A549裸鼠腫瘤質量及抑瘤率的影響

2.2 復方丹皮酚納米乳對人肺癌A549裸鼠血清IL-2、TNF-α含量的影響 由表3結果可見，與正常對照組比較，荷瘤對照組裸鼠血清IL-2、TNF-α表達水平均明顯降低(P<0.001、P<0.001)。與荷瘤對照組比較，復方丹皮酚納米乳高劑量組和康萊特注射液組裸鼠血清IL-2表達水平明顯升高(P<0.01、P<0.01)，復方丹皮酚納米乳中、高劑量組和康萊特注射液組裸鼠血清TNF-α表達水平明顯升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)。

3 討論

本研究前期體外實驗結果顯示，復方丹皮酚納米乳呈時間-劑量依賴性地抑制肺癌A549細胞的增殖，抑制腫瘤細胞從G0/G1期向S期轉變，并誘導腫瘤細胞凋亡[6]。由于腫瘤細胞在體內外的生長環境不同，研究所得出的結論具有一定的局限性。為了進一步評價復方丹皮酚納米乳對肺癌的作用，本研究通過建立人源肺癌 A549裸鼠移植瘤模型，給予不同劑量的復方丹皮酚納米乳進行治療。實驗結果表明，復方丹皮酚納米乳對人肺癌A549裸鼠移植瘤體積增長和腫瘤質量具有一定的抑制作用，抑瘤率在10.89%～32.95%之間，其中復方丹皮酚納米乳在高劑量水平下抑制作用最佳，呈現一定的量效關系，這與體外實驗的研究結論一致，為復方丹皮酚納米乳抗肺癌研究提供了新的實驗依據。

表3 復方丹皮酚納米乳對人肺癌A549裸鼠血清IL-2、TNF-α含量的影響

腫瘤的發生發展與機體的免疫功能密切相關，血清中的IL-2主要由T細胞分泌，是腫瘤免疫治療的重要細胞因子。IL-2能增強T細胞的殺傷活性，不僅能在體外直接殺傷腫瘤細胞[7]，并可誘導T細胞分泌IFN-γ、TNF、CSF等細胞因子增強抗腫瘤活性[8]。本實驗研究結果表明，復方丹皮酚納米乳可有效提高裸鼠血清中的IL-2含量，從而減少體內的腫瘤細胞。TNF-α是一種由激活的巨噬細胞產生的可直接殺傷腫瘤細胞的細胞因子，也是迄今為止發現具有殺傷腫瘤細胞活性最強的細胞因子。有研究報道，TNF-α能夠激活CD8+T細胞、NK細胞及LAK細胞等釋放穿孔素和IFN-γ，從而對腫瘤細胞發揮毒性作用，促使腫瘤的消退[9-10]。本實驗結果表明，復方丹皮酚納米乳可通過提高裸鼠血清中的TNF-α含量，增強抗腫瘤效應。

綜上所述，復方丹皮酚納米乳可抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞因子IL-2和TNF-α表達，初步揭示了其抑瘤作用機理可能與免疫調節有關。本實驗研究結果顯示復方丹皮酚納米乳的抗腫瘤作用以高劑量水平治療效果最佳，由于實驗過程中劑量設置范圍較窄，并不能確定復方丹皮酚納米乳的最佳治療劑量，對其抗腫瘤作用機制也僅進行了初步探討，所以復方丹皮酚納米乳對人源肺癌A549裸鼠移植瘤的最佳治療劑量和抗腫瘤作用機制仍需進一步研究。