大豆GmGolS2-1基因高溫脅迫誘導表達及轉基因煙草鑒定

邱爽　張軍　何佳琦　李銘楊　周雨明　鄔長樂　袁洪淼　劉嘉儀　翟瑩

摘要： 肌醇半乳糖苷合成酶（GolS）是棉籽糖系列寡糖（RFO）生物合成途徑中的關鍵酶，在植物應對非生物脅迫過程中發揮重要作用。實時熒光定量RT-PCR結果顯示，高溫脅迫可以誘導GmGolS2-1在大豆幼苗中的表達。將GmGolS2-1基因構建到植物表達載體pRI101上并通過葉盤法轉化煙草，經卡那霉素抗性篩選，PCR及qRT-PCR檢測共獲得6株陽性轉基因煙草植株（OE1～OE6）。對野生型煙草植株和GmGolS2-1轉基因煙草植株進行高溫脅迫處理，結果顯示野生型煙草的電解質滲透率和丙二醛含量均高于轉基因煙草。由此推測GmGolS2-1可以提高轉基因煙草的耐熱性。

關鍵詞： 大豆;肌醇半乳糖苷;GolS基因;高溫脅迫;轉基因煙草

中圖分類號： S565.1 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0038-06

Expression of soybean GmGolS2-1 induced by heat stress and identification of GmGolS2-1 transgenic tobacco

QIU Shuang1， ZHANG Jun2， HE Jia-qi1， LI Ming-yang1， ZHOU Yu-ming3， WU Chang-le1， YUAN Hong-miao1， LIU Jia-yi1， ZHAI Ying1

（1.College of Life Science and Agro-Forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， China;2.Branch of Animal Husbandry and Veterinary of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Qiqihar 161005， China;3.Jilin Zhongzhi Jiufang Consulting Co.， Ltd.， Changchun 130000， China）

Abstract： Galactinol synthase （GolS） is the key enzyme in the biosynthetic pathway of raffinose family oligosaccharides （RFOs）， which plays an important role in the response to abiotic stresses of plants. The results of real-time fluorescence quantitative RT-PCR showed that the expression of GmGolS2-1 could be induced by high temperature stress in soybean seedlings. The GmGolS2-1 gene was constructed into expression vector pRI101 in plants and was transformed into tobacco using leaf disc method. Six positive transgenic tobacco plants （OE1-OE6） were obtained by kanamycin resistance screening， PCR and qRT-PCR. The wild-type and GmGolS2-1 transgenic tobacco plants were treated with heat stress. The results showed that the electrolyte leakage and malondialdehyde content of wild-type tobacco were both higher than that of transgenic tobacco. These data indicate that GmGolS2-1 can increase the tolerance to heat stress of transgenic tobacco.

Key words： soybean;galactinol;GolS gene;heat stress;transgenic tobacco

植物在遭受不良環境條件后，可以誘導合成大量滲透調節物質來增加植物細胞的滲透壓，提高植物抵抗脅迫的能力，從而維持植物自身的代謝和生長發育。其中棉子糖系列寡糖（Raffinose family oligosaccharides， RFO）就是這些滲透調節物質的典型代表。它們是高等植物中含量僅次于蔗糖的一類可溶性糖，在逆境脅迫條件下可以維持細胞膨壓，保持細胞穩定性，降低植物氧化性損傷，維持光合作用正常進行[1-3]。肌醇半乳糖苷合成酶（Galactinol synthase， GolS）是RFO生物合成途徑中的關鍵酶，它所催化的UDP-半乳糖和肌醇合成肌醇半乳糖苷的反應既是RFO代謝通路中的第一步，也是限速步驟[4]。

GolS基因在植物中以多基因家族形式存在，不同GolS基因在抵御非生物脅迫過程中的作用也各不相同。擬南芥中含有7個GolS基因，其中AtGolS1和AtGolS2可以被干旱和高鹽脅迫誘導上調表達，AtGolS3可以被低溫脅迫誘導上調表達[5]。AtGolS1和AtGolS2過表達轉基因植株中肌醇半乳糖苷和棉籽糖含量均增加，對氧化脅迫的耐受能力增強[6]。越來越多的研究結果顯示，GolS基因在應對高溫脅迫過程中同樣發揮重要作用。AtGolS1是熱激因子HSF3的調控靶基因，在高溫脅迫下可以促進棉籽糖的合成[7]。葡萄VvGOLS1基因能夠被高溫處理上調表達[8]。高溫和氧化脅迫可以誘導鷹嘴豆CaGolS1的表達，將其在擬南芥中過表達可以降低活性氧的積累從而提高轉基因植株的耐熱性[9]。

大豆作為一種重要的經濟作物，其GolS基因的功能鑒定對于大豆RFO代謝途徑及大豆抗逆機制的研究都具有重要意義。但到目前為止，有關大豆中GolS基因與高溫脅迫反應之間的關系的研究尚未見報道。本研究對大豆GmGolS2-1基因在高溫脅迫下的表達量進行檢測，并將其轉化煙草進行耐熱性鑒定。

1 材料與方法

1.1 植物材料及高溫脅迫處理

試驗材料為齊齊哈爾地區廣泛種植的大豆抗逆品種北豆9號。在Hoagland營養液中水培大豆幼苗，待大豆幼苗第一片三出復葉完全展開時進行高溫脅迫處理：將大豆幼苗置于42 ℃培養箱中，分別在脅迫處理的0 h、1 h、2 h、5 h和10 h，剪取0.1 g第一片三出復葉并迅速置于液氮中，于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續總RNA的提取。

1.2 實時熒光定量RT-PCR

使用RNAiso Plus試劑（TaKaRa公司產品）提取各樣本的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和OD260/OD280值檢測提取RNA的質量。使用cDNA反轉錄試劑盒（Novoprotein公司產品）合成第一鏈cDNA。利用Primer 5軟件設計GmGolS2-1（GenBank登錄號：NM001354866）實時熒光定量RT-PCR引物。上游引物序列：5′-GCGGTGATGGATTGTTTCTG-3′;下游引物序列：5′-GTGGGCTTGGTGAGTTGGA-3′。使用大豆組成型表達基因β-Tubuin（GenBank登錄號：GMU12286）作為內參基因，上游引物序列：5′-GGAAGGCT TTCTTGCATTGGTA-3′;下游引物序列：5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′）[10]。在BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR儀設置反應程序如下：95 ℃預變性30 s;95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共循環40次。實時熒光定量RT-PCR反應體系如下：2×TB Green Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa公司產品） 10.0 μl、cDNA 2.0 μl、上下游引物各0.8 μl，補充水至總體積20.0 μl。所有處理3次重復，采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

1.3 植物表達載體的構建

使用限制性內切酶Nde I和EcoR I雙酶切pMD18-T-GmGolS2-1重組質粒（本實驗室前期構建）和植物表達載體pRI101，分別切膠回收酶切片段后利用Ligation kit 2.0（TaKaRa公司產品）進行連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒進行雙酶切驗證。將驗證后的重組載體質粒pRI101-GmGolS2-1轉化農桿菌EHA105。

1.4 煙草遺傳轉化及篩選

通過農桿菌侵染葉盤法將重組載體pRI101-GmGolS2-1轉化煙草NC89[11]。在含有50 mg/L卡那霉素的MS培養基上篩選煙草抗性苗。待煙草抗性苗生根后提取DNA作為模板，以pRI101-GmGolS2-1重組質粒作為陽性對照，野生型煙草葉片DNA作為陰性對照，對轉基因抗性苗進行PCR檢測。提取轉基因及野生型煙草葉片RNA并進行反轉錄。使用煙草組成型表達基因α-Tubuin（GenBank登錄號：AB052822）作為內參基因（上游引物序列：5′-ATGAGAGAGTGCATATCGAT-3′;下游引物序列： 5′-TTCACTGAAGAAGGTGTTGAA-3′）[10]，目的基因引物同方法1.2 實時熒光定量RT-PCR中引物，對轉基因煙草中的GmGolS2-1基因的表達量進行檢測，實時熒光定量RT-PCR方法同1.2，每個株系3次重復。

1.5 轉基因煙草耐熱性檢測

將營養缽中土培56 d的T1代轉基因煙草植株置于42 ℃培養箱中進行高溫處理。在處理48 h時進行相對電解質滲透率和丙二醛含量的檢測。電解質滲透率測定：取0.1 g煙草葉片剪碎，加入5 ml去離子水浸泡1 h，測定電導率D1，之后置于沸水中10 min，冷卻后測定電導率D2。相對電解質滲透率計算公式：D1/D2×100%。 丙二醛含量的測定參照Shao等[12]的方法進行。每個處理3次重復。

1.6 數據處理

數據的差異顯著性分析采用Students t檢驗。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫下GmGolS2-1的表達分析

為了檢測GmGolS2-1在大豆中是否能夠響應高溫脅迫，利用實時熒光定量RT-PCR對其高溫脅迫下的表達動態進行分析。結果（圖1）顯示，GmGolS2-1的表達量隨著高溫處理時間延長逐漸升高，在處理10 h時達到最大值，是對照（0 h）的139倍。表明GmGolS2-1在大豆幼苗中能夠響應高溫脅迫，可能在大豆應對高溫脅迫過程中發揮作用。

2.2 GmGolS2-1植物表達載體構建

利用引物兩端的限制性內切酶位點，構建GmGolS2-1植物表達載體。如圖2所示，質粒雙酶切鑒定結果表明GmGolS2-1已經整合進植物表達載體pRI101中。農桿菌菌液PCR鑒定結果（圖2）顯示已獲得含有重組載體pRI101-GmGolS2-1的轉基因工程菌。

2.3 GmGolS2-1轉基因煙草的篩選及鑒定

煙草遺傳轉化如圖3所示，在卡那霉素抗性培養基上篩選煙草愈傷組織（圖3A），待抗性芽長至1 cm時（圖3B）將其移入生根培養基中，待根系生長正常后（圖3C）再移入土中正常培養。

PCR檢測結果顯示，共獲得6株陽性轉基因煙草植株，分別命名為OE1～OE6（圖4A）。對轉基因煙草植株中GmGolS2-1基因的表達量進行檢測，野生型煙草中沒有GmGolS2-1基因的表達，OE4植株中GmGolS2-1基因的表達量最高，其次是OE2植株，因此后續選擇OE4和OE2植株進行耐高溫脅迫鑒定（圖4B）。

2.4 轉基因煙草耐熱性鑒定

高溫脅迫處理后，OE2和OE4轉基因煙草植株中的相對電解質滲透率均低于野生型煙草，且OE4達到顯著程度（圖5A）。丙二醛含量檢測結果（圖5B）顯示，OE2和OE4轉基因煙草植株與野生型煙草植株在未處理（0 h）時的丙二醛含量沒有顯著差異;高溫脅迫處理48 h后，丙二醛含量均升高，但OE2和OE4轉基因煙草植株中的丙二醛含量均低于野生型煙草植株，且OE4達到顯著程度。以上結果表明，GmGolS2-1在煙草中的持續過表達可以減少高溫脅迫對煙草細胞質膜完整性的破壞，提高轉基因煙草的耐熱性。

3 討論

作物在生長發育過程中常常遭受各種逆境脅迫，其中高溫可以對作物的生長發育造成不可逆轉的影響，且高溫常常伴隨著干旱及各種病害的發生，是導致作物減產質量降低的主要因素之一。當植物遭受高溫脅迫時，相關轉錄因子可以激活脅迫相關基因的表達。GolS是RFO生物合成起始的關鍵限速酶，它通過催化UDP-半乳糖和肌醇反應合成肌醇半乳糖苷，再以此為供體，在棉籽糖合成酶和水蘇糖合成酶的作用下將蔗糖合成棉籽糖和水蘇糖等寡糖[13]。這些可溶性糖不僅可以作為細胞中的滲透調節物質，還可以作為植物適應環境的信號物質[14]。因此，GolS基因對植物抵抗逆境脅迫意義重大。

GolS屬于多基因家族，僅在擬南芥中就發現了10個編碼GolS的基因[15]。我們在大豆基因組中共獲得6個GolS基因堿基序列，它們對非生物脅迫的應答模式并不相同。基因表達量檢測結果顯示，GmGolS2-1是一個典型的高溫脅迫誘導表達基因。基因的表達模式往往與基因功能密切相關，由此推測GmGolS2-1可能在大豆耐熱生理中起重要作用。前人也有過類似報道，例如鷹嘴豆CaGolS1可以應答高溫脅迫，將其在擬南芥中過表達可以提高轉基因植株的耐熱性[9]。但到目前為止，有關GolS基因與高溫脅迫反應之間的關系的研究相比其與其他非生物脅迫反應還比較少，耐熱機制也不甚明了。Wang等[16]認為，丹參中的3個GolS基因能夠被高溫脅迫誘導表達，可能是這些基因上游的啟動子序列中含有HSF轉錄因子結合的順式作用元件，轉基因試驗結果也驗證了此觀點。

植物在遭受外界逆境脅迫后通常會在形態上出現一系列的變化，如葉片萎蔫、葉色褪綠、幼苗死亡等[17-18]。但是單純的形態學觀察常常會產生極大的誤差，因此可以通過檢測某些與抗逆相關的生理指標來鑒定不同植株的抗逆能力。高溫脅迫會導致植物脫水，影響植物體內自由基產生和消除的平衡，進而導致過氧化作用，破壞細胞膜的完整性，對細胞造成傷害[19]。電解質滲透率增大是植物遭受逆境脅迫后細胞膜通透性增大的最直觀體現，細胞膜通透性增大會導致細胞中物質大量流失，進而影響細胞正常的生理功能并最終影響植物的正常生長發育[20]。丙二醛是植物膜脂過氧化的產物，其含量可作為判斷植物受損傷程度的一項重要生理指標[21]。因此，電解質滲透率和丙二醛含量可以在一定程度上反應植株的抗逆能力。TaGolS3轉基因擬南芥和水稻在鋅離子脅迫下活性氧清除相關基因的表達量升高，其電解質滲透率和丙二醛含量均低于野生型對照，由此提高了轉基因植株對重金屬脅迫的抗性[22]。本研究中，GmGolS2-1轉基因煙草植株在高溫處理下葉片電解質滲透率及丙二醛含量均低于野生型對照組，證明GmGolS2-1基因可以降低高溫脅迫對煙草葉片造成的傷害，提高轉基因煙草的耐熱性。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-06-29

基金項目：黑龍江省普通本科高等學校青年創新人才培養計劃項目（UNPYSCT-2017153）;黑龍江省省屬高等學校基本科研業務費科研項目（植物性食品加工技術特色學科專項）（YSTSXK201878）;黑龍江省省屬高等學校基本科研業務費科研項目（135209264）;齊齊哈爾大學研究生創新科研項目（YJSCX2019050）

作者簡介：邱 爽（1995-），男，山東濟寧人，碩士研究生，主要從事大豆分子育種研究。（E-mail）qs187143@163.com

通訊作者：翟 瑩，（Tel）15845640163;（E-mail）fairy39809079@126.com