組蛋白乙酰化修飾調(diào)控NF-κB驅(qū)動的PNPLA3基因表達的機制初探

許曉?陳蕓芝?徐芬?梁華

【摘要】目的 探討禁食/再喂食后小鼠肝臟Patatin樣磷脂酶域蛋白3（PNPLA3）基因啟動子核因子-κB（NF-κB）結(jié)合區(qū)域組蛋白H3K9乙酰化（H3K9ac）水平以及相關去乙酰化酶（HDAC）和乙酰化轉(zhuǎn)移酶（HAT）的變化特點。方法 根據(jù)體質(zhì)量將18只C57BL/6小鼠隨機分為3組各6只，分別為自由飲食組、禁食組（夜間饑餓24 h）和再喂食組（饑餓24 h后再自由攝食高蔗糖含量飼料12 h），分別予自由飲食、禁食和禁食后再喂食干預，檢測并比較各組肝臟PNPLA3、NF-κB、HDAC（SIRT1、SIRT6）和HAT（GCN5、Elp3）基因表達情況，用染色質(zhì)免疫共沉淀-定量PCR檢測H3K9ac富集水平，并分析H3K9ac與PNPLA3表達的相關性。結(jié)果 3組比較，C57BL/6小鼠肝臟PNPLA3、NF-κB基因表達在禁食時下調(diào)，再喂食后又上調(diào)（P均< 0.001）。H3K9ac水平變化與PNPLA3變化趨勢一致（P均< 0.05），相關分析提示兩者具有相關性（rs = 0.958， P < 0.001）;禁食組SIRT1和SIRT6表達水平較自由飲食組高，再喂食組兩者水平均下降（P均< 0.05），與H3K9ac變化趨勢相反;GCN5、Elp3表達變化與SIRT1及SIRT6類似（P均< 0.05）。結(jié)論 SIRT1和SIRT6相關H3K9去乙酰化涉及飲食調(diào)節(jié)NF-κB驅(qū)動的PNPLA3的表達。

【關鍵詞】Patatin樣磷脂酶域蛋白3;組蛋白 H3K9 乙酰化;禁食/再喂食;核因子-κB

Preliminary study of the mechanism of histone acetylation modification in regulating NF-κB-driven PNPLA3 gene expression in liver Xu Xiao， Chen Yunzhi， Xu Fen， Liang Hua. Department of Endocrinology and Metabolism， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangdong Provincial Key Laboratory of Diabetology， Guangzhou? 510630， China

Corresponding author， Liang Hua， E-mail： lianghua@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To characterize the changes in the levels of H3K9 acetylation （H3K9ac） around the Nuclear factor-κB （NF-κB） binding site of PNPLA3 gene promoter and the expression levels of related deacetylase （HDAC） and acetyltransferase （HAT） enzymes in the liver of C57BL/6 mice during the fasting/re-feeding transition. Methods According to the weight， 18 C57BL/6 mice were randomly assigned into the ad libitum feeding group （n = 6）， fasting group （n = 6， fasting for 24 h during night） and re-feeding group （n = 6， 24-h fasting followed by ad libitum re-feeding with high sucrose diet for 12 h）. Mice were subjected to fasting/re-feeding interventions. The expression levels of PNPLA3， NF-κB， HDAC （SIRT1， SIRT6） and HAT （GCN5， Elp3） genes were detected and compared among three groups. The H3K9ac enrichment level was assayed by using ChIP-qPCR. Correlation analysis was performed to analyze the relationship between H3K9ac and PNPLA3 expression levels. Results The expression levels of PNPLA3 and NF-κB genes in C57BL/6 mouse liver were significantly down-regulated during fasting and then significantly up-regulated after re-feeding （all P < 0.001）. The changes in the H3K9ac expression level were consistent with those in PNPLA3 （all P < 0.05）. Correlation analysis suggested a significant association between H3K9ac and PNPLA3 expression levels （rs = 0.958， P < 0.001）. The expression levels of SIRT1 and SIRT6 in the fasting group were significantly higher compared with those in the ad libitum feeding group， which were significantly down-regulated in re-feeding groups （all P < 0.05）， contrary to the changing trend of H3K9ac. The changes in the expression levels of GCN5 and Elp3 were similar with those of SIRT1 and SIRT6 （all P < 0.05）. Conclusions SIRT1 and SIRT6-associated H3K9 deacetylation may be involved in the dietary regulation of NF-κB-driven PNPLA3 expression.

【Key words】Patatin-like phospholipase-domain-containing 3;H3K9 acetylation;

Fasting/re-feeding;Nuclear factor-κB

非酒精性脂肪肝（NAFLD）與飲食關系密切。近年來有研究顯示，頻繁重復的長時間禁食（間歇禁食）具有改善NAFLD的作用，但具體分子機制尚未明確[1-2]。NAFLD是復雜性狀疾病，其發(fā)病是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，表觀遺傳學修飾是在不改變DNA序列的情況下環(huán)境調(diào)控基因表達的關鍵環(huán)節(jié)[3]。既往研究表明，飲食和營養(yǎng)可通過表觀遺傳改變?nèi)旧w結(jié)構和功能從而改變基因表達，形成多樣性生物表型[4]。因此我們推測，表觀遺傳學修飾是間歇性禁食啟動肝臟基因表達調(diào)控的關鍵。Patatin樣磷脂酶域3 （PNPLA3）主要表達于肝臟組織，是NAFLD的主要易感基因[5]。我們的前期研究顯示核因子-κB（NF-κB）調(diào)控PNPLA3表達參與PNPLA3基因 I148M多態(tài)性相關NAFLD炎癥進展[6]。在人類和動物實驗中，禁食可改善NAFLD炎癥狀態(tài)，其機制是否涉及表觀遺傳學修飾調(diào)控NF-κB驅(qū)動的PNPLA3表達尚不清楚[7-8]。因此本課題組擬在禁食/再喂食干預小鼠中初步探討肝臟PNPLA3、NF-κB基因表達，PNPLA3基因啟動子NF-kB結(jié)合區(qū)域組蛋白H3賴氨酸9乙酰化（H3K9ac）水平以及H3K9相關去乙酰化酶和乙酰化轉(zhuǎn)移酶的變化特點， 為揭示間歇性禁食改善NAFLD的機制奠定基礎。

材料與方法

一、動 物

7 ～ 8周齡雄性C57BL/6鼠18只，體質(zhì)量20 ～ 25 g，購自南京大學南京生物醫(yī)藥研究院。

二、試 劑

對照飼料（AIN93純化型標準飼料）以及高蔗糖飼料（65%蔗糖含量）購自南通特洛菲飼料科技有限公司（中國）;染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）試劑盒（貨號：17-10086） 購自Millipore公司（美國）;動物組織RNA提取試劑盒（貨號：74134）購自QIAGEN（德國），定量PCR （qPCR） 試劑盒（貨號：04707516001）購自Roche公司（美國）;逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）試劑盒5x All-In-One RT Master Mix （貨號：G490） 購自Abm公司（加拿大）。免疫共沉淀使用CST公司（美國）的anti-H3k9Ac抗體（9649s），陰性對照組rabbit lgG抗體（B900610）購自Proteintech（中國）。

三、方 法

1.小鼠自由飲食、禁食和再喂食干預

18只C57BL/6J小鼠分為3只/籠，共6籠，自由取水和飲食，環(huán)境溫度為22℃，濕度為60%。適應性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)體質(zhì)量將其隨機分為3組各6只，分別為自由飲食組、禁食組（夜間饑餓24 h）和再喂食組（饑餓24 h后再自由攝食高蔗糖含量飼料12 h）。干預結(jié)束后留取小鼠肝臟組織進行后續(xù)檢測。本動物實驗倫理經(jīng)中山大學實驗動物管理與使用委員會審批通過（SYSU-IACUC-2020-000175）。

2. 染色質(zhì)免疫共沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）

從每組中取4只小鼠進行ChIP-qPCR，將

20 mg小鼠肝臟組織（大約含5×106個肝臟細胞）剪碎成1 mm3組織小塊后用1%甲醛交聯(lián)，再使用勻漿儀將其研磨至單細胞狀態(tài)，依次加入ChIP試劑盒提供的細胞裂解液及細胞核裂解液，解析出染色質(zhì)，隨后使用Diagenode公司（比利時）的Bioruptor UCD-200非接觸式全自動超聲波破碎儀剪切染色質(zhì)至200 ～ 1000 bp，后續(xù)步驟嚴格按照ChIP試劑盒說明進行。免疫共沉淀用anti-H3k9Ac抗體，使用兔lgG抗體作為陰性對照。提純的DNA使用qPCR試劑盒進行擴增定量，所用正向引物：5-GGAAAGACAGCATGTGGATGGT-3，反向引物：5-GATGCTTGCTGGGCAGAATG-3，產(chǎn)物覆蓋PNPLA3啟動子的NF-κB結(jié)合區(qū)域。用占input的百分比（% input）來表示免疫沉淀樣品中H3K9ac在PNPLA3啟動子NF-κB結(jié)合區(qū)域的富集度。

3. RT-PCR和qPCR

為檢測肝臟PNPLA3、NF-κB、H3K9相關去乙酰化酶（SIRT1、SIRT6）、乙酰化酶（GCN5、Elp3）mRNA水平，使用組織RNA提取試劑盒，提取每組所有小鼠肝臟RNA，使用Nanadrop2000分光光度計測定總RNA濃度和純度，OD260/280、OD260/230在1.9 ～ 2.1提示純度較高。使用ABM公司試劑盒進行RT-PCR，反應條件為：25℃ 10 min，42℃ 15 min，85℃ 5 min，反應產(chǎn)物為互補DNA（cDNA）。以cDNA為模板，使用試劑盒進行qPCR實驗， 反應條件：90℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個循環(huán); 95℃ 5 s，65℃ 15 s，95℃ continuous;40℃ 30 s。本研究所用qPCR引物序列如表1。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)，用GraphPad Prism 8.0作圖，各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，計量資料用表示，多組定量資料比較用方差分析，兩兩比較用Dunnet-t法（比較自由飲食組和禁食組、禁食組和再喂食組）。相關分析中變量不符合正態(tài)分布，使用Spearman秩相關分析。P < 0.05 （雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、禁食/再喂食對小鼠肝臟PNPLA3和NF-κB表達的影響

禁食組小鼠肝臟PNPLA3表達水平較自由飲食組低，再喂食組PNPLA3表達水平最高。NF-κB在各組的表達趨勢與PNPLA3一致，即在禁食時表達下調(diào)，禁食后再喂食表達上調(diào)，見表2。

二、禁食/再喂食對小鼠肝臟PNPLA3啟動子NF-kB結(jié)合位點附近區(qū)域H3K9ac富集水平的影響

小鼠肝臟PNPLA3轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域H3K9ac的水平在禁食/再喂食轉(zhuǎn)換過程中的變化與PNPLA3的表達趨勢一致，表現(xiàn)為禁食組H3K9ac水平較自由飲食組低（0.135±0.007 vs. 0.379±0.171，P < 0.05），再喂食組較禁食組高（0.780±0.064 vs. 0.135±0.007，P < 0.001），見圖1。相關分析顯示PNPLA3的基因表達和H3K9ac水平呈正相關

（rs = 0.958， P < 0.001）。

三、禁食/再喂食對小鼠肝臟H3K9ac 相關修飾酶表達的影響

禁食/再喂食時去乙酰化酶SIRT1以及SIRT6變化和H3K9ac的變化模式相反，均表現(xiàn)為禁食組表達水平較自由飲食組高（P < 0.05），再喂食組較禁食組低（P < 0.05），見圖2A、B。GCN5和Elp3是增加組蛋白乙酰化水平的乙酰化酶，在禁食/再喂食中GCN5和Elp3的表達特征與SIRT1和SIRT6類似，在禁食組中表達水平高（P < 0.05），在再喂食組中表達水平低（P < 0.05），與 PNPLA3啟動子H3K9ac水平的變化不相符，見圖2C、D。

討論

NAFLD與2型糖尿病、心血管疾病關系密切，是全球重要的公共健康問題之一，其治療方法主要是生活方式干預[9-10]。不斷增加的研究證據(jù)顯示，間歇禁食具有改善NAFLD的作用，但其作用機制尚未明確[1-2]。PNPLA3基因是NAFLD主要易感基因，其表達受禁食再喂食狀態(tài)調(diào)節(jié)，提示PNPLA3可能參與間歇禁食改善NAFLD的機制[5， 11-12]。PNPLA3基因表達調(diào)控機制尚未被完全闡明。NF-κB等對PNPLA3表達的調(diào)控已被本課題組及其他研究者證實[6， 12]。環(huán)境因素對基因表達的調(diào)控是通過誘導基因表觀遺傳學修飾實現(xiàn)的。UCSC數(shù)據(jù)庫顯示人或小鼠肝臟和肝細胞PNPLA3基因啟動子存在超染色質(zhì)活性區(qū)域和H3K9ac等豐富的組蛋白乙酰化修飾。但組蛋白乙酰化修飾調(diào)控PNPLA3基因表達的機制尚未見報道。在本研究中，我們初步探討了禁食/再喂食時小鼠PNPLA3基因啟動子NF-κB結(jié)合區(qū)域附近H3K9ac水平隨能量狀態(tài)變化的特點，以及可能調(diào)控H3K9乙酰化和去乙酰化酶表達水平的變化，為了解環(huán)境與基因相互作用促進NAFLD發(fā)生發(fā)展提供實驗依據(jù)，也為揭示間歇禁食改善NAFLD的機制提供了新思路。

我們的前期研究證實NF-κB是PNPLA3的直接轉(zhuǎn)錄因子[6]。在本研究中，NF-κB表達受營養(yǎng)狀態(tài)影響，禁食時表達降低，再喂食后表達增加，該結(jié)果與既往研究報道一致[8]。組蛋白乙酰化/去乙酰化可通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構影響轉(zhuǎn)錄因子和基因啟動子結(jié)合而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。因此，我們檢測到的PNPLA3啟動子NF-κB結(jié)合區(qū)域H3K9ac的富集水平在禁食時下降可能導致染色質(zhì)結(jié)構致密而減弱NF-κB與PNPLA3啟動子結(jié)合，降低PNPLA3表達，提示了低H3K9乙酰化抑制NF-κB驅(qū)動的PNPLA3表達可能涉及間歇禁食改善NAFLD的機制。

組蛋白乙酰化修飾過程處于動態(tài)平衡，并由組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶共同調(diào)控。表觀遺傳學數(shù)據(jù)庫Histome數(shù)據(jù)庫（www.iiserpune.ac.in）及WERAM數(shù)據(jù)庫（http：//weram.biocuckoo.org/）顯示，調(diào)控H3K9ac的去乙酰化酶為SIRT1、SIRT6，乙酰化酶為GCN5及Elp3。SIRT1和SIRT6表達下調(diào)是NAFLD發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[13-15]。肝臟SIRT1和SIRT6表達也受營養(yǎng)狀態(tài)調(diào)控，我們發(fā)現(xiàn)SIRT1和SIRT6表達水平在禁食時升高，再喂食后表達水平降低，這與既往研究結(jié)果一致[15-16]。此外，禁食/再喂食中SIRT1和SIRT6表達變化趨勢與PNPLA3基因表達和PNPLA3啟動子 H3K9ac水平相反，提示SIRT1和SIRT6可能涉及PNPLA3啟動子H3K9ac水平調(diào)控。

GCN5和Elp3是H3K9ac相關乙酰化酶，涉及基因表達的增加。但在我們的研究中，禁食/再喂食時GCN5和Elp3表達表現(xiàn)出與預期（即禁食時降低再喂食后增加）相反的趨勢，提示GCN5和Elp3可能不是調(diào)控PNPLA3基因H3K9ac水平的乙酰化酶。既往報道GCN5主要參與糖異生基因表達的轉(zhuǎn)錄抑制，由于PNPLA3基因功能不涉及糖代謝，GCN5可能不涉及PNPLA3基因表達的表觀遺傳學調(diào)控機制[17]。Elp3的相關研究主要集中在腫瘤研究，在代謝領域較少，其在禁食/再喂食中表達的變化效應和機制尚需要更進一步的實驗來揭示。

綜上所述，禁食/再喂食可能影響H3K9ac水平，調(diào)控NF-κB驅(qū)動的PNPLA3表達，SIRT1和SIRT6可能是負責此調(diào)控作用的去乙酰化酶。在本研究中我們對PNPLA3基因表觀調(diào)控機制的探討尚淺，需進一步行體內(nèi)外研究，更深入探討SIRT1、SIRT6與H3K9ac之間的關系以及SIRT1和SIRT6對NF-κB與PNPLA3啟動子結(jié)合力及轉(zhuǎn)錄活性的影響。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-11-25）

（本文編輯：洪悅民）