鞘氨醇單胞菌的特性及應用研究進展

張 穎，楊 悅，韋慶慧，趙 敏

(東北林業大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

Pseudomonaspaucimobil曾被定義為產黃色素、極性單鞭毛、非發酵的革蘭氏陰性棒狀桿菌，歸屬為假單胞菌屬(Pseudomonas),其細胞脂質中含有大量獨特的鞘氨醇脂和2-羥基肉豆蔻酸。而Yabuuchi等[1]研究發現，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)具有特殊的膜外成分鞘氨醇，不同于假單胞菌屬，因此被重新定義為新屬。1994年，Takeuchi等[2]報道Sphingomonas屬于變形菌門的α亞類，是第4組的一部分。Yamamoto等[3]首次在Sphingomonas中發現了一種新的鞘氨醇脂，結構鑒定為N-2′-羥基肉豆蔻酰二羥鞘氨醇-1-葡萄糖醛酸(SGL-1)。根據16S rDNA序列的系統發育分析結果，以及細胞脂質中含有SGL-1和2-羥基肉豆蔻酸(發酵單胞菌中的非羥基肉豆蔻酸)，將其分類于一個新的鞘氨醇單胞菌科。2001年，研究者根據16S rRNA基因序列進行系統化分析，將鞘氨醇單胞菌分為四個簇，并根據系統發育、化學分類和生理學特征提出除Sphingomonas之外的三類新屬：Sphingobium、Novosphingobium和Sphingopyxi，統稱為Sphingomonads[4]。這三個屬的模式菌分別為Sphingobiumyanoikuyae、Novosphingobiumcapsulatum和Sphingopyxismacrogoltabida。不同屬所含多胺類型不同，Sphingomonas中主要含同型高亞精胺，Sphingobium、Novosphingobium和Sphingopyxi中主要含亞精胺[5]。

1 鞘氨醇單胞菌的特性

鞘氨醇單胞菌隸屬于鞘氨醇桿菌目的鞘氨醇單胞菌科，需氧，革蘭氏陰性，桿狀，無芽孢，單鞭毛運動，能氧化戊糖、己糖和雙糖產酸。該菌接觸酶呈陽性，產水溶性類胡蘿卜素，使其菌落一般呈黃色，但不產黃單胞菌素。所有菌株可在無機培養基中利用H2、O2、CO2等營化能自養生活，也可利用葡萄糖等作為碳源營化能異養生活[6]。最適生長溫度為25～30 ℃，最適pH值為6.5～7.5。鞘氨醇單胞菌除了革蘭氏反應、賴氨酸和鳥氨酸脫羧、精氨酸脫水、硝酸氣體和葡萄糖發酵外，沒有其它常見的生化特性。

此前鞘氨醇脂曾被認為僅是真核生物細胞膜中的重要成分之一。Bauwens等[7]通過DNA-RNA雜交技術證明Flavobacteriumcapsulatum、Flavobacteriumdevoran細胞膜與鞘氨醇脂有密切關系，因此將該類菌株獨立于假單胞菌屬分類。迄今為止，尚未見其它細菌物種中含有鞘氨醇脂的相關報道，故鞘氨醇脂可作為鞘氨醇單胞菌鑒定的生物化學標志物。這些物種中鞘氨醇脂的出現是確定其生物分類位置的重要化學標準，它們的脂肪酸譜由作為主要脂肪酸的C18∶1ω7c和作為主要羥基化脂肪酸的C14O2-OH組成。它們以泛醌Q-10為主要呼吸道醌，以亞精胺為主要多胺[4]。

近年來，研究者發現鞘氨醇單胞菌能夠利用多種有機化合物，可在低營養條件下生長和繁殖，廣泛存在于自然生境中，包括湖泊、河流、海洋及陸地等[2](表1)。

Kosako等[17]根據細菌的生長情況，對20株鞘氨醇單胞菌進行了表型和抑菌試驗，圖1是采用Kirby-Bauer法，利用MuellerHinton培養基Ⅱ和Sensi圓盤對36種抗菌藥物的敏感性評估結果。

由圖1可知，藥敏試驗結果也各不相同,只有菌株S.macrogoltabidus對阿莫西林-克拉維酸呈中性，其它菌株對其皆呈敏感性；所有菌株對四環素、強力霉素、米諾環素、丁氨卡那霉素均呈敏感性；只有菌株S.ursincola對慶大霉素、卡那霉素有抗性，其它菌株呈敏感性；菌株S.rosa、S.sanguinis、S.parapaucimobilis、S.macrogoltabidus對阿莫西林和氨芐西林有抗性；所有菌株均對甲氧安啶有抗性等。

表1 鞘氨醇單胞菌屬不同種屬信息

2 鞘氨醇單胞菌的應用

由于鞘氨醇單胞菌卓越的生物降解和生物質合成能力，在環境、農業、食品及工業生產等諸多領域具有廣泛的市場應用價值[1]。自然分布的某些鞘氨醇單胞菌種類與人類健康和環境安全息息相關[18]。

2.1 鞘氨醇單胞菌的環境污染物降解作用

2.1.1 對多環芳烴的降解

多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由兩個或兩個以上的苯環以線形排列、彎接或簇聚的方式構成的一類有毒、稠合的苯環類化合物。環境中的PAHs主要來源于煤和石油的燃燒，可隨煙塵粒子排入大氣，由于其自身的疏水性及低水溶性，可以迅速融入沉積環境，造成污染。在人體內對PAHs的代謝過程中往往伴隨著大量自由基的產生，自由基具有很強的親電性，極易與各種生物大分子結合，導致酶失活、蛋白質結構變化、DNA斷鏈、脂質過氧化等一系列氧化損傷，引發人類呼吸系統、神經系統、肝臟和腎臟等組織器官的疾病[19]。PAHs可被認為是影響人類健康的主要有機污染物，危害極大。

圖1 20株鞘氨醇單胞菌對36種抗菌藥物的敏感性Fig.1 Sensitivity of 20 Sphingomonas strains to 36 antibacterial drugs

研究發現，鞘氨醇單胞菌對土壤中萘、聯苯、間二甲苯及菲類等芳香族化合物的降解效果顯著[20-23]，在PAHs生物修復中具有廣闊的應用前景。其中，菲因其具有3個相連的苯環而被作為PAHs的代表，可用于評價微生物對PAHs的降解能力。Pinyakong等[24]發現鞘氨醇單胞菌對菲類物質的降解效率較高，并首次在鞘氨醇單胞菌的菲降解產物中分離到了苯并香豆素和l,5-二羥基-2-萘甲酸，證實了菲可被氫基化雙加氧酶在1,2位攻擊，其后的二元醇產物可在脫氫酶和間位裂解酶的催化下產生2-羥基-1-萘甲酸，經水楊酸途徑進一步降解[21]。此外，也有研究者提出細菌可以通過鄰苯二甲酸鹽途徑降解菲類物質[25-26]。如Gong等[27]發現菲與雙加氧酶和脫氫酶氧化反應后，最初代謝為1-羥基-2-萘甲酸，繼而轉化為1-萘酚，進一步反應生成水楊酸和鄰苯二酚，后者通過三羧酸循環完全礦化[28-29](圖2[19])。

圖2 細菌降解菲的水楊酸途徑和鄰苯二酚途徑Fig.2 Salicylic acid pathway and catechol pathway for degradation of phenanthrene by bacteria

2.1.2 對農藥殘留物的降解

人工化學合成的農藥具有難降解、有毒等特點，對環境污染嚴重，破壞生態平衡，影響農業可持續發展。

氯乙酰苯胺類除草劑(CH)是常用農藥之一，對大豆、棉花或玉米田中的一年生草和闊葉雜草具有顯著的出苗前控制效果。在過去的幾十年中，CH已成為美國、歐洲和許多發展中國家最受歡迎的除草劑之一，其廣泛使用已引起土壤和地下水的非點源污染，可能引起人類或其它動物細胞DNA損傷[30-31]。

研究[32-33]表明，采用微生物法降解農藥殘留物具有高效、經濟、環保及無二次污染等優勢，已得到廣泛應用。Cheng等[34]首次報道了鞘氨醇單胞菌DC-6對CH具有有效的降解能力。Chen等[35]對CH的降解途徑進行了深入研究，發現鞘氨醇單胞菌有一個共同的CH降解途徑，分上游、下游和環裂三個途徑(圖3)。菌株DC-6降解CH的上下游途徑是通過水平基因轉移和基因組合進行的。在CH降解的上游途徑中，與苯胺基相連的兩個側鏈分別脫烷基和酰胺水解。N-脫烷基酶CndABC是一種三組分的Rieske非血紅素鐵加氧酶系統[36]，N-脫烷基后，乙草胺轉化為2-Cl-N-(2-甲基-6-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)，CmeH將其酰胺水解為2-甲基-6-乙基苯胺(MEA)。乙草胺降解的下游途徑由MEA的對羥基化啟動；在菌株中，相應的基因被鑒定為雙組分黃素依賴單加氧酶系統MeaXY。脫氨后，4-OH-MEA自發或酶法轉化為2-甲基-6-乙基對苯二酚(MEHQ)[37-38]。MEHQ通過MeaAB羥基化為3-羥基-2-甲基-6-乙基對苯二酚(3-OH-MEHQ)，這是一種雙組分黃素依賴性單加氧酶。DC-6利用MEA作為生長的唯一碳源，表明菌株都存在環裂生長途徑。Dong等[38]研究表明，含有meaAB的惡臭假單胞菌KT2440可以利用3-OH-MEHQ作為生長的碳源。因此，環切割酶可能不是保守的蛋白質。由于3-OH-MEHQ的化學結構與羥基喹啉相似，因此在羥基喹啉的基礎上提出了乙草胺降解的環裂途徑。此外，環切割途徑的基因并不保守，可能是由細菌降解羥基喹啉直接進化而來。該研究對微生物分解代謝途徑提供了新的見解。

圖3 鞘氨醇單胞菌降解CH機理Fig.3 Mechanism of degradation of CH by Sphingomonas

2.2 鞘氨醇單胞菌提取物的抗氧化衰老作用

生物抗氧化劑是指與可氧化底物相比，當其濃度較低時，可顯著延遲或阻止該底物氧化任何物質[39]?？寡趸瘎┠軠p弱活性氧的破壞作用，并能減輕或逆轉許多表皮毒性的疾病。因此，自由基作用的加強或延長可以抑制活性氧防御機制，促進對抗衰老。皮膚中存在各種有效的抗氧化劑，包括抗壞血酸、尿酸、類胡蘿卜素和硫氫化物。除了植物和真菌等天然產物中含有抗衰老的活性物質可制成生物抗氧化劑外，研究者發現有多種細菌提取物也具有抗衰老作用[40]。其中，鞘氨醇單胞菌因胞內過氧化氫酶和氧化酶作用，產生獨特的類胡蘿卜素，具有抗氧化和耐受環境脅迫作用。

2.2.1 類胡蘿卜素的作用

類胡蘿卜素是一種輔助的聚光色素，同時也是一種保護劑，可以抵御紫外線輻射和氧自由基的毒性影響，廣泛存在于多種細菌、藻類、真菌和植物中，是最顯著的膜結合抗氧化劑[41]。當細菌細胞由于代謝而受到氧化應激時，在細菌細胞膜中積累的類胡蘿卜素可能會抑制活性氧，減少氧擴散穿過細胞膜[42]，從而降低其致死作用。據報道，在膜中積累的類胡蘿卜素還可能減少雜環插入的空間，并減少相互作用的程度[43]。另一種假設是類胡蘿卜素對膜流動性有反應，這一點有待研究證實。類胡蘿卜素可以防止年齡相關性黃斑變性和腫瘤的形成，作為藥物具有很好的應用前景。目前，類胡蘿卜素的工業化生產主要是從植物組織中提取或化學合成。因此，類胡蘿卜素微生物生產系統的大規模開發具有很大的市場潛力。

2.2.2 鞘糖脂提取物的作用

衰老的最初階段是通過持續激活p53-p21或/和p16-Rb通路，從短暫的細胞周期停滯發展到穩定的細胞周期停滯。由此產生的早期衰老細胞通過下調層粘連蛋白B1，從而觸發廣泛的染色質重塑，從而產生衰老相關的分泌表型(SASP)。Gervason等[44]發現鞘氨醇單胞菌提取物可抑制SA-β-半乳糖苷酶的表達和細胞周期抑制劑(p21和p16)的表達，延緩細胞衰老。同時，研究發現蛋白聚糖(versican)和原纖維蛋白-1(Fibrillin-1)經鞘氨醇單胞菌提取物處理后可使表達量增加，有效延緩衰老，促進細胞增殖以確保組織修復和吸水。Carrino等[45]比較了從胎兒到成年和衰老階段的不同年齡組的versican變化，隨著年齡的增加，versican的含量逐漸減少。而且，高含量的versican已被證明可以保護成纖維細胞免于凋亡。表明鞘氨醇單胞菌提取物具有促增殖和抗衰老作用。

2.3 鞘氨醇單胞菌與植物互作

Wang等[46]研究了鞘氨醇單胞菌(SaMR12)對非寄主植物芥菜的影響，發現在鉻處理下，鞘氨醇單胞菌能在根中定植、聚集并向芽移動，提高植株耐鉻能力。與未接種的植株相比，接種鞘氨醇單胞菌后不僅降低了幼苗過氧化氫(H2O2)和丙二醛(MDA)含量，而且降低了幼苗和根系脯氨酸含量。此外，鞘氨醇單胞菌的接種提高了超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性，提高了抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環中脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)的相關基因表達水平和催化活性。SOD、POD、CAT和APX均是植物抗重金屬脅迫的重要抗氧化酶[47-48]。在該研究中，鉻暴露提高了芽和根中的SOD和POD活性，降低了芽中的APX活性，在低濃度鉻時CAT活性升高，高濃度鉻時CAT活性反而降低。在許多研究中都報道了類似的趨勢[49-53]。研究表明，用鞘氨醇單胞菌-鉻處理時影響AsA-GSH抗氧化系統[54]，鉻處理提高了東南紅豆杉根的GSH水平和GR水平[55]。結果表明，鉻暴露對GSH含量和GR、DHAR表達水平有影響，而鞘氨醇單胞菌的接種提高了GSH含量，促進了GR、DHAR的表達。因此，在鉻脅迫下，接種鞘氨醇單胞菌可通過降低H2O2、MDA和脯氨酸含量，提高抗氧化酶活性，調節AsA-GSH循環。這些研究為超積累植物內生細菌作為修復劑在非寄主植物中提高重金屬耐性的潛在應用提供了理論依據。

3 展望

鞘氨醇單胞菌廣泛存在于自然生境中，與人類生活息息相關，其在降解環境污染物、抗氧化衰老、與植物互作等領域的研究已成為當前熱點。近些年，研究者已初步揭示了鞘氨醇單胞菌提取物在抗氧化方面的作用、對環境污染物降解的機理，證明了微生物應用于環境修復的可能性。研究發現，鞘氨醇單胞菌在抗氧化、抗重金屬等領域中能發揮明顯作用，具有開發為微生物菌劑的市場價值。但原位生物修復作用、微生物復合菌劑構建和生物安全性等問題仍需進一步研究闡明。由于該菌是近些年重新分離的新種，關于該菌細胞膜內含酸性鞘氨醇脂的形成機制尚不明確，調控產鞘氨醇脂的基因也還未知，是否借鑒了真核生物基因等問題還有待深入研究。鞘氨醇單胞菌耐受高度貧氧環境，有特殊的代謝機制，在農業、工業和醫藥產業的應用上具有獨特市場價值，其應用前景不可估量。