早產合并認知障礙大鼠糞便短鏈脂肪酸水平變化

薛正陽，盧紅艷，唐煒，樂濤

(江蘇大學附屬醫院兒科，江蘇 鎮江 212001)

研究發現，腸道菌群改變與認知發育異常存在明顯相關性[1]。人類腸道菌群多樣性和豐度下降與自閉癥發生密切相關[2]，且與糞便短鏈脂肪酸含量變化有關。短鏈脂肪酸是一組少于六個碳的有機脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，前三者占腸道中短鏈脂肪酸95%以上。對自閉癥患兒的研究發現，主要產丁酸的腸道菌群豐度降低，產戊酸相關細菌豐度增加，糞便中乙酸和丁酸含量較低，戊酸水平較高[3]。腹腔注射丁酸鈉可減輕自閉癥小鼠社交功能缺陷[4]。另一項研究發現，抑郁癥患者糞便中乙酸及丙酸明顯較低，將其糞便微生物群移植到缺乏微生物群的大鼠身上會傳播焦慮樣行為[5]。以上研究結果提示，腸道菌群代謝產物短鏈脂肪酸可能直接影響大腦功能。目前，糞便短鏈脂肪酸變化是否會導致早產后認知障礙尚不明確。本研究應用高通量測序與氣相色譜技術定量檢測早產認知障礙大鼠糞便腸道菌群以及短鏈脂肪酸含量，探討腸道菌群及其代謝產物短鏈脂肪酸與早產后認知障礙發生的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑與儀器

60只SPF級健康孕16～17 d SD孕鼠，11周齡，體質量(410±40) g，由江蘇大學動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號：SYXK(蘇)2013-0036。

脂多糖(美國Sigma公司)；Morris水迷宮實驗相關儀器由江蘇大學醫學院實驗室提供；Illumina MiSeq測序儀(美國Illumina公司)；Onedrop儀器(南京五義科技有限公司)；GC-14B型氣相色譜儀(日本Shimadzu公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 認知障礙大鼠模型制備參考本實驗室方法[6]。將60只孕鼠隨機分成實驗組與對照組，每組30只，實驗組連續2 d腹腔注射脂多糖，對照組注射PBS；孕21 d(足月為22～23 d)對兩組孕鼠行剖宮術取出早產大鼠，獲得30只實驗組早產大鼠和15只對照組早產大鼠。通過定位航行實驗，從實驗組早產大鼠中篩選出21只得分低的早產大鼠作為認知障礙組，從對照組早產大鼠中篩選出10只作為對照組。比較兩組大鼠在定位航行實驗中找到平臺平均時間，采集大鼠糞便，并于-80 ℃保存待用。

1.2.2 高通量測序檢測腸道菌群 糞便腸道菌群檢測采用高通量測序16S rRNA檢測方法[6]，提取的基因組建庫后，在MiSeq平臺上進行300×2 bp測序，該測序服務由天益健康科學研究院(鎮江)有限公司提供。

菌群數據應用Ribosomal Database Project (RDP) Classifier 2.3軟件，與細菌數據庫Silva(v129)，生成各樣品分類學數據。采用PICRUSt方法，分析各樣品中菌群代謝基因豐富度及多樣性。

1.2.3 氣相色譜技術檢測糞便短鏈脂肪酸含量 取1 g糞便樣本，加入超純水5 mL，振蕩混勻；取 1 mL上清液，按照5 ∶1加入偏磷酸巴豆酸混合溶液(內標)，-20 ℃保存過夜；解凍后12 000 r/min離心10 min；取上清液再加入樣品1 mL，迅速振蕩搖勻。測定前再12 000 r/min離心10 min；取上清液直接進樣，用 1.0 μL微量進樣器瞬時注入色譜儀，進樣量為0.2～1.0 μL。通過標準樣品和內標巴豆酸各自的峰面積計算出各個樣品中乙酸、丙酸及丁酸濃度。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 定位航行實驗

早產認知障礙大鼠找到平臺的平均時間[(40±5)s]明顯長于對照組[(18±4)s，t=13.29,P<0.01]。

2.2 大鼠糞便腸道菌群多樣性指數分析

Chao1及Ace指數常代表菌群豐富度，Shannon 指數及Simpson 指數常代表菌群多樣性。認知障礙組Chao1、Ace及Shannon指數明顯低于正常對照組 (P均<0.05)，兩組間Simpson 指數比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠腸道菌群豐富度及多樣性指標比較

2.3 大鼠糞便腸道菌群分析

從門水平而言，擬桿菌門與厚壁菌門構成所有樣本中主要優勢菌群。其中，認知障礙組變形菌門豐度較對照組增加(P<0.05)，其他菌門比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。從目、屬水平而言，與對照組比較，認知障礙組大鼠腸道中乳桿菌屬、擬桿菌目明顯降低(P均<0.05)。見表3。

表2 兩組大鼠腸道菌群門水平優勢菌群比較

表3 兩組大鼠腸道菌群目、屬水平優勢菌群比較 M(P25，P75)，%

2.4 兩組大鼠糞便短鏈脂肪酸變化

經檢驗分析，認知障礙組總短鏈脂肪酸與乙酸水平明顯低于對照組(P均<0.05)，其他短鏈脂肪酸差異無統計學意義(P均>0.05)。見表4。

表4 兩組大鼠糞便短鏈脂肪酸含量比較 M(P25，P75)，μmol/g

2.5 糞便短鏈脂肪酸與代表菌屬的相關性分析

將認知障礙組大鼠短鏈脂肪酸與腸道菌群進行Spearman相關分析發現，乳酸桿菌、擬桿菌與乙酸呈一定的正相關(r=0.488，0.361，P均<0.05)。

3 討論

定位航行實驗是一種研究動物大腦認知功能的經典實驗手段。本研究結果顯示，在定位航行實驗中，與對照組相比，早產認知障礙大鼠找到平臺的平均時間明顯延長，提示造模成功，表明認知障礙組存在認知障礙。

SD大鼠1月齡與人類2～5歲即幼兒期等同，此時能充分評估認知功能發育正常與否，且Morris水迷宮實驗是評估嚙齒類動物認知障礙的金標準，故早產大鼠出生30 d后，通過Morris水迷宮實驗中的定位航行實驗，可證明早產大鼠是否存在認知障礙。

腸道菌群結構的改變與認知障礙聯系緊密。Liu等[7]研究發現，與對照組相比，認知障礙患者腸道菌群多樣性下降。Kelly等[8]發現，患有認知障礙疾病患者腸道菌群數量與多樣性較健康者顯著降低。Cattaneo等[9]發現，輕度認知障礙患者體內變形菌門豐度增加。以上研究表明，認知障礙患者腸道菌群結構發生明顯變化。本研究發現，與對照組相比，認知障礙組早產大鼠腸道菌群豐富度及多樣性下降，擬桿菌門及厚壁菌門這兩種優勢菌門豐度降低，變形菌門豐度明顯增加，同樣提示認知障礙大鼠腸道菌群結構發生明顯變化，表明腸道菌群結構改變可能是早產合并認知障礙的重要原因。

腸道中乳桿菌及擬桿菌與認知功能障礙關系密切。Yu等[10]發現，抑郁癥模型大鼠乳桿菌水平相對豐度較低；Saji等[11]發現，認知功能障礙患者擬桿菌水平較低。本研究對腸道菌群分析，同樣發現認知障礙組早產大鼠腸道擬桿菌目及乳桿菌屬豐度明顯減低。妊娠20周至產后3歲為腦發育關鍵期，而腸道菌群的定植也發生在該關鍵窗口期。在該窗口期內，若腸道菌群紊亂，短期有感染增加和炎癥進程延長風險，長期可導致神經發育異常。

腸道菌群產生的短鏈脂肪酸對大腦功能和行為有顯著影響。小膠質細胞在大腦發育、可塑性和認知方面起關鍵作用。Erny等[12]研究顯示，短鏈脂肪酸能促進大腦小膠質細胞發育，影響少突膠質細胞前體細胞分化和髓鞘形成。在無菌模型小鼠中[12]，短鏈脂肪酸受體缺失，大腦小膠質細胞整體缺陷，提示短鏈脂肪酸是調節小膠質細胞成熟和功能的關鍵分子。此外，血腦屏障形成也與短鏈脂肪酸有關[13]，由細菌產生的短鏈脂肪酸可降低血腦屏障通透性。給無菌小鼠補充可產生短鏈脂肪酸的細菌，小鼠血腦屏障恢復正常，提示調節短鏈脂肪酸含量，就有可能維持血腦屏障功能[13]。本研究中，認知障礙組總短鏈脂肪酸水平與乙酸水平明顯低于對照組，也表明短鏈脂肪酸減少對大腦認知功能形成產生影響。

乳桿菌與擬桿菌是常見的產乙酸菌。研究表明，口服乳酸桿菌12周可明顯改善認知功能[14]。阿爾茨海默病模型小鼠的糞便和腦組織短鏈脂肪酸含量降低，而通過口服乙酸鹽能改善小鼠腦神經損傷及認知功能障礙[15]。由此提示，總短鏈脂肪酸及乙酸含量下降可能會導致認知功能障礙，且總短鏈脂肪酸及乙酸濃度降低可能與乳桿菌降低有關[16]。本研究分析發現，乙酸與擬桿菌目、乳桿菌屬呈一定正相關性，提示早產合并認知障礙大鼠腸道內乙酸含量下降可能與擬桿菌目、乳桿菌屬含量下降有關。擬桿菌目、乳桿菌屬水平下降所導致的總短鏈脂肪酸及乙酸水平下降可能導致早產合并認知障礙。研究發現，大鼠自閉癥樣行為可由腦室內高濃度丙酸引起[17]。Liu等[3]研究發現，自閉癥患兒糞便中丁酸含量較低。本研究中，認知障礙組丙酸與丁酸含量與對照組相比無統計學差異，表明丙酸及丁酸改變是否與早產后認知障礙有關尚需進一步研究。本研究建立于動物模型，短鏈脂肪酸是否造成人類早產合并認知障礙，需要進一步的人體試驗論證。此外，本實驗缺乏糞群移植等干預手段；未來研究可增加干預手段，多角度觀察論證菌群及其代謝產物與早產認知障礙的關系。

綜上所述，早產認知障礙大鼠的腸道菌群特征為變形菌門富集與擬桿菌目、乳桿菌屬含量降低。其擬桿菌目及乳桿菌屬低豐度所致總短鏈脂肪酸與乙酸下降可能導致早產合并認知功能障礙。