南瓜SWEET蛋白家族的全基因組鑒定與進化分析

申長衛 袁敬平

摘 要： SWEET（sugar will eventually be exported transporter）家族是一種新型的糖轉運體，該家族基因在碳水化合物運輸、發育、環境適應性和寄主-病原相互作用等多個過程中發揮著重要作用。為更好地了解南瓜發育的分子機理，該研究基于已知的南瓜基因組數據庫，利用生物信息學方法對中國南瓜SWEET基因（CmSWEET）的系統發育樹、基因結構、跨膜結構、保守基序、啟動子預測、共線性預測和基因復制等進行綜合分析。結果表明：共鑒定到21個CmSWEET 基因，通過系統發育分析將21個CmSWEET基因分為4個亞族（I，II，III和IV），分別包含3、5、10和3個基因。此外，通過基因結構、跨膜結構域和保守基序發現CmSWEET在進化過程中是非常保守的。染色體定位結果顯示，CmSWEET基因不均勻地分布在21條中國南瓜染色體中的13條染色體上，且在染色體Cm00、Cm01、Cm03、Cm05、Cm07、Cm09、Cm19和Cm20上不存在。啟動子順式作用元件分析顯示，CmSWEET基因與植物激素（脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸和生長素）響應有關，也可能參與各種環境脅迫的響應。從系統進化發育樹和基因共線性方面揭示了CmSWEET基因與印度南瓜SWEET（CmaSWEET）之間的進化關系。該研究在全基因組水平上系統地鑒定了中國南瓜中SWEET基因家族，為進一步了解中國南瓜和其他葫蘆科作物SWEET基因提供了基礎，也為進一步的功能分析提供了重要的候選基因。

關鍵詞： 南瓜， SWEET， 系統發育分析， 共線性， 順式作用元件， 生物信息學

Abstract： SWEET （sugar will eventually be exported transporter） is a new type of sugar transporter， which plays important roles in carbohydrate transport， development， environmental adaptability and host pathogen interaction. In order to better understand the molecular mechanism of pumpkin development， we used bioinformatics methods to comprehensively analyzed the phylogenetic tree， gene structure， transmembrane structure， conserved motif， promoter prediction， collinearity prediction and gene replication of the Cucurbita moschata SWEET gene （CmSWEET）， based on the known pumpkin genome database. The results were of follows： 21 CmSWEET genes were identified and divided into four subfamilies （I， Ⅱ， Ⅲ and IV） by phylogenetic analysis， including 3， 5， 10 and 3 genes respectively. In addition， the gene structure， transmembrane domain and conserved motif showed that CmSWEET genes were very conserved in evolution. The results of chromosome mapping showed that CmSWEET genes were unevenly distributed on 13 of 21 chromosomes and did not exist on chromosomes Cm00， Cm01， Cm03， Cm05， Cm07， Cm09， Cm19 and Cm20. Analysis of promoter cis-acting element showed that the CmSWEET genes were related to plant hormone response （abscisic acid， methyl jasmonate， salicylic acid and auxin）， and may also participate in response to various environmental stresses. Finally， the phylogenetic relationship was revealed from phylogenetic tree and gene collinearity. This study systematically identified the SWEET genes family in C. moschata at the whole genome level， which provided a basis for further understanding the SWEET gene of C. moschatas and other Cucurbitaceae crops， and also provided an important candidate gene for further functional analysis.

Key words： pumpkin， SWEET， phylogenetic analysis， collinearity， cis-acting elements， bioinformatics

可溶性糖，如蔗糖、葡萄糖和果糖是光合作用的主要產物，可作為碳骨架的來源，用于許多其他細胞化合物、信號、滲透壓細胞和運輸分子的生物合成，并可作為瞬時能量儲存（Feng & Frommer， 2015）。在植物中，糖在源葉中合成，并且可以通過韌皮部從葉片運輸到根、莖、花、果實和種子，為新細胞的生長和發育提供營養（Ruan， 2014;Miao et al.， 2017）。糖類化合物不能獨立跨植物生物膜系統進行運輸，而需要相應糖轉運蛋白介導細胞或亞細胞間隔的吸收或釋放。迄今為止，三種糖轉運蛋白家族已被鑒定，即單糖轉運蛋白（monosaccharide transporters， MSTs）（Slewinski， 2011）、蔗糖轉運蛋白（sucrose transporters， SUTs）（Kühn & Grof， 2010;Ayre， 2011）和糖外排轉運蛋白（sugars will eventually be exported transporters， SWEETs）（Chen et al.， 2010），它們決定著作物的產量和質量（Eom et al.， 2015）。

MSTs和SUTs為MFS超家族，具有12個跨膜結構域（Kühn & Grof， 2010;Ayre， 2011;Slewinski， 2011）。SWEETs是最近發現的一類糖外流轉運蛋白，選擇性地在細胞內或質膜上轉運單糖或雙糖，它們屬于MtN3家族（Chen， 2014;Eom et al.， 2015）。SWEET廣泛分布于各種生物中，包括原核生物、動物和植物（Patil et al.， 2015）。真核SWEET蛋白在結構上具有7次跨膜α-螺旋（Trans Membrane Helix， TMH/TM），由2個具有3次重復的TMH組成的MtN3基序和位于其中起連接作用的1個TMH構成（陳慧敏等，2017;Liu et al.， 2019）。與真核SWEET蛋白相反，原核SWEET蛋白（即半SWEET蛋白）僅含有一個3-TM，這可能表明真核SWEET蛋白是通過復制和融合原核半SWEET蛋白中存在的基本3-TM單元而進化來的（Xuan et al.， 2013）。

目前，對SWEET的功能研究在短柄草、高粱、番茄、葡萄、大豆、玉米和茉莉花等多個物種中進行了部分報道（Yuan & Wang， 2013;Chong et al.， 2014;Feng et al.， 2015;Patil et al.， 2015;Sosso et al.， 2015;胡麗萍等，2017;王盼盼，2019），研究較深的主要集中在擬南芥和水稻上（Chen et al.， 2010;Xuan et al.， 2013）。相關研究發現SWEET基因參與對脅迫的響應（Seo et al.， 2011）、宿主與病原菌互作（Slewinski， 2011;Cong et al.， 2014;Hu et al.， 2014）和植物衰老的調控（Zhou et al.， 2014）等生理過程，也參與糖的運輸、分配和貯藏及生殖生長的發育（Le et al.， 2015;李安琪，2017;馮超陽，2018）。越來越多的研究表明，植物SWEET基因可能在糖轉運方面起廣泛作用。

中國南瓜（Cucurbita moschata）是世界上重要的經濟和營養蔬菜作物之一。甜度是南瓜口感的關鍵指標，而南瓜SWEET基因家族在糖轉運方面的功能及作用機理仍不清楚。據我們所知，目前還沒有對葫蘆科南瓜作物SWEET基因家族進行系統的研究報道。此外，南瓜基因組的測序（Sun et al.， 2017）促進了南瓜SWEET基因家族成員的研究。本文對中國南瓜SWEET基因的系統發育、染色體分布、基因結構、結構域、順式作用調控元件和系統進化關系進行了詳細分析，鑒定了印度南瓜SWEET基因，為瓜類SWEET基因家族的研究以及進一步探討南瓜SWEET基因家族對糖分轉運的功能提供有價值的信息。

1 材料與方法

1.1 中國南瓜SWEET基因家族的鑒定

從擬南芥信息資源（http：//arabidopsis.org）中獲得的17個AtSWEETs基因用作查詢序列。依據已獲得的擬南芥SWEET基因，對南瓜基因組數據庫（http：//cucurbitgenomics.org/）進行BLASTP分析，確定候選基因。去除冗余序列后，中國南瓜的所有候選SWEET蛋白序列都被提交到SMART數據庫（http：//smart.embl-hei-delberg.de）（Letunic et al.， 2015）和Pfam數據庫中（http：//pfam.xfam.org）（Finn et al.， 2016），消除不包含已知的MtN3/唾液/SWEET家族成員保守結構域和基序的基因。用同樣的方法從南瓜基因組數據庫中檢測出印度南瓜SWEET基因家族成員。

運用ExPASy的“Compute pI/Mw”工具（http：//web.expasy.org/compute_pi/）來預測南瓜SWEET蛋白的等電點和分子量;運用Plant-mPLoc server（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）預測每個SWEET基因的亞細胞定位;運用TMHMM Server v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測SWEET蛋白質跨膜（TM）螺旋數量。

1.2 中國南瓜SWEET基因的染色體分布

在南瓜數據庫中獲取SWEET基因的起始位置、終止位置和染色體長度，利用TBtools繪制中國南瓜全基因組CmSWEET基因家族成員分布圖。

1.3 中國南瓜SWEET的結構分析和蛋白互作分析

在南瓜數據庫中獲取SWEET基因的cDNA及其相應基因的DNA序列，在此基礎上利用在線軟件GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/） （Hu et al.， 2015）繪制CmSWEETs的外顯子-內含子結構圖。利用在線軟件MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）（Bailey & Elkan， 1995）對中國南瓜SWEET蛋白的保守基序進行預測和分析。MEME參數設置：motif數量為10，motif長度為5～50。以擬南芥SWEET蛋白為參考蛋白，利用在線STRING Version11.0平臺進行分析。

1.4 中國南瓜SWEET啟動子中的順式作用元件分析

在數據庫中獲得SWEET基因的閱讀框，利用TBtools獲取起始密碼子的前2 000 bp。在此基礎上將所有基因的啟動子序列使用PLant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行預測，對產生的數據進行統計分析。

1.5 多序列比對和系統發育樹構建

通過ClustalW對所有南瓜SWEET蛋白進行多序列比對。中國南瓜SWEET蛋白與印度南瓜和擬南芥SWEET蛋白的系統發育關系由MEGA 5.10構建（Tamura et al.， 2011）。使用成對刪除空位的選項，采用bootstrap法對進化樹進行評估，重復值設為1 000。

1.6 中國南瓜SWEET基因的共線性和基因復制

利用TBtools獲取中國南瓜SWEET基因在印度南瓜和擬南芥中的共線性基因及這些基因在染色體上的位置。用Circos（Krzywinski et al.， 2009）軟件繪制SWEET基因的共線關系圖。

使用TBtools程序對所有SWEET的CDS序列進行兩兩比對，并使用公式計算基因的比對覆蓋率：基因比對覆蓋率=（比對長度-錯配）/較大基因的長度。依據先前在白菜物種的報道，當氨基酸一致性>80%、E期望值<1×10-10且基因比對覆蓋率>0.75時，這些基因被認為是復制對（Yuan et al.， 2019）。當兩個基因間隔小于100 kb時被認為是串聯復制基因（Wang et al.， 2010）。使用KaKs calculator計算同義替換率（Ks），依據公式T=Ks / 2λ×10-6（MYA）（Emanuelsson et al.， 2000）來計算SWEET基因的分化時間（T），式中λ為1.5×10-8。

2 結果與分析

2.1 南瓜SWEET基因家族成員的鑒定及其在染色體上的分布

由表1可知，從中國南瓜基因組中共鑒定出21個具有保守結構域的CmSWEET基因。21個CmSWEET基因根據其在擬南芥中的同源基因命名。每個AtSWEET基因對應1～5個CmSWEET基因。CmSWEET基因的開放閱讀框（ORF）的長度在597～918 bp之間，編碼多肽的長度在198～305 aa之間。這些SWEET多肽的分子量（Da）和等電點（pI）分別為21 998.71～33 974.59 Da和7.51～9.83。此外，除了CmSWEET12c在線粒體中、CmSWEET17a在細胞膜/高爾基體/過氧化物酶體中，其他CmSWEETs都定位在細胞膜上。

由圖1可知，共有21個CmSWEET基因位于21條染色體中的13條染色體上。染色體Cmo15含有最多的CmSWEET基因（4個，19%），而染色體Cmo00、Cmo01、Cmo03、Cmo05、Cmo07、Cmo09、Cmo19和Cmo20上沒有CmSWEET基因。染色體Cmo10上含有3個CmSWEET基因，染色體Cmo11、Cmo12和Cmo13上都含有2個CmSWEET基因，其余每一條染色體含有1個CmSWEET基因。由表2可知，共線性分析發現共有4對同源基因對，分別是CmSWEET1a_CmSWEET1b、CmSWEET12a_CmSWEET12d、CmSWEET10a_CmSWEET10b、CmSWEET7b_CmSWEET7c，其中依據氨基酸序列一致性>80%和基因比對覆蓋率>0.75，本研究在中國南瓜染色體上共發現1對片段復制基因對（CmSWEET10b_CmSWEET10a），Ka/Ks<1.0表明這些復制對主要經歷了純化選擇，分化時間為20.13 MYA。

2.2 中國南瓜SWEET蛋白的跨膜結構分析

使用默認值以FASTA格式提交給TMHMM Server v. 2.0推測了中國南瓜SWEET蛋白21個成員的氨基酸序列。圖2結果顯示，17個CmSWEET蛋白有7個TMs，1個CmSWEET蛋白有5個TMs，其余的3個CmSWEET蛋白（CmSWEET1b、CmSWEET5b和CmSWEET7b）有6個TMs。

2.3 中國南瓜SWEET蛋白的系統發育及結構分析

為更好地了解南瓜SWEET基因的進化起源和功能，利用Clustal Omega和MEGA 5.10軟件，通過對21個CmSWEET蛋白序列和17個AtSWEET蛋白序列進行比對，構建了無根系統發育樹。這些SWEET蛋白序列被分為4個亞族（圖3）。圖3比較了中國南瓜和擬南芥四個不同分支中的SWEET蛋白數量。每個分支都包含CmSWEET和AtSWEET。詳細地說，第I亞族包含3個CmSWEETs （CsSWEET1a、CsSWEET1b和CsSWEET3）和3個AtSWEETs （AtSWEET1-3）;第Ⅱ亞族包含5個CmSWEETs （CmSWEET5a-5b、CmSWEET7a-7c）和5個AtSWEETs （AtSWEET4-8）;第Ⅲ亞族包含9個CmSWEETs （CsSWEET9、CsSWEET10a-10b、CsSWEET12a-12e和CsSWEET15a-15b）和7個AtSWEETs （AtSWEET9-15）;第IV亞族包含3個CmSWEETs （CmSWEET17a-17c）和2個AtSWEETs （AtSWEET16-17）（圖3）。

對基因結構的分析可以為CmSWEET基因家族的外顯子-內含子和系統發育關系提供有價值的信息。在構建的系統發育樹的基礎上，利用GSDS工具分析了21個CmSWEET基因的外顯子-內含子結構、內含子階段和保守基序（圖4）。基序分析發現基序1、2、3和5在所有的中國南瓜SWEET蛋白中都存在（圖4： A， B;圖5）;基序4只在CmSWEET17b中不存在，基序7除在CmSWEET12a、CmSWEET17b蛋白中缺失，在其他蛋白中都存在;基序6只在第Ⅲ、第IV亞族中存在;基序8、9、和10只存在個別蛋白中（圖4： B）。外顯子-內含子分類模式與系統發育樹一致（圖4： C）。在中國南瓜SWEET基因家族中，所有CmSWEET基因的基因組序列都含有內含子。CmSWEET12a-12d、15a-15b、10a-10b、9、17a、17c、1a-1b、3和5a包含6個外顯子，除CmSWEET15a外，它們的內含子階段模式相似（圖4： C）。

CmSWEET12e、7a-7c都包含5個外顯子，除CmSWEET12e外，它們的內含子階段模式相似。此外，CmSWEET17b和CmSWEET5b分別含有3個和4個外顯子，且具有不同的內含子階段模式（圖4：C）。

2.4 中國南瓜SWEET基因啟動子順式作用調控元件的研究

為了解CmSWEETs基因的轉錄調控，我們從翻譯起始位點（ATG）提取了21個基因的2.0 kb上游序列。在PlantCARE服務器上對21個基因上游序列中的順式元件進行分析。圖6：A為順式作用元件在啟動子上的位置。值得注意的是，在CmSWEETs的啟動子區共鑒定出9種植物激素響應順式元件，包括1種脫落酸響應元件（ABRE）、2種茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA基序和TGACG基序）、3種赤霉素響應元件（GARE基序、P-box和TATC-box）、1個水楊酸響應元件（TCA元件）和2個生長素響應元件（TGA-box和AuxRR-core）（圖6：B）。21個CmSWEET基因的啟動子至少含有一個植物激素響應元件。CmSWEET7b含有最多（15個）植物激素響應元件（圖6： B）。CmSWEET基因除了受植物激素響應元件的調控外，還可能對各種環境脅迫，如厭氧、高溫、低溫、干旱和晝夜節律（圖6：B）。厭氧響應元件除在CmSWEET12d中不存在，存在所有的CsSWEET啟動子中（圖6），提示這些基因在厭氧誘導中的重要作用。然而，晝夜節律僅在CmSWEET12e、CmSWEET10a和CmSWEET17a中存在（圖6： B）。這些數據表明CmSWEET可能通過一個復雜的機制參與環境脅迫，并且每個CmSWEET基因都可以被不同的環境脅迫所誘導。

2.5 中國南瓜SWEET蛋白相互作用關系網絡分析

根據模式物種擬南芥中的同源序列，構建了中國南瓜SWEET蛋白相互作用關系網絡。由圖7可知，CmSWEET5a對應AtSWEET5（AtVEX1）;CmSWEET9對應AtSWEET9;CmSWEET1a對應AtSWEET1;CmSWEET12a對應AtSWEET12; CmSWEET17a對應AtSWEET17;CmSWEET7a對應AtSWEET7;CmSWEET3對應AtSWEET3。圖7結果顯示，CmSWEET9分別與CmSWEET5a和CmSWEET1a;CmSWEET17a分別與CmSWEET12a、CmSWEET3和CmSWEET7a存在互作關系。

2.6 中國南瓜與印度南瓜SWEET蛋白系統發育分析

采用與中國南瓜相同的方法，從印度南瓜基因組中共鑒定到19個CmaSWEET基因（表3）。根據擬南芥的同源基因命名了19個CmaSWEET基因。無根進化樹顯示19個CmaSWEET被分為4個大分支，與前面中國南瓜SWEET的分類一致（圖8）。其中，在CmaSWEET中，中國南瓜SWEET家族中第IV亞族成員又被分為3個小分支。每個大分支都包含中國南瓜SWEET蛋白和印度南瓜SWEET蛋白。從綜合來看，兩個栽培種SWEET蛋白系統進化相對保守。

2.7 中國南瓜與印度南瓜和擬南芥SWEET基因的共線性分析

利用TBtools工具獲取CmSWEET基因在CmaSWEET和AtSWEET基因中的共線性基因，并對這些共線性關系進行了統計。圖9結果表明，中國南瓜與印度南瓜SWEET的共線性基因對數目（18）大于中國南瓜與擬南芥的共線性基因對數目（12）。此外，統計中國南瓜SWEET基因在印度南瓜和擬南芥中的拷貝數的結果（圖9，表4）發現，CmSWEET10a和CmSWEET10b對應印度南瓜1個SWEET基因（CmaSWEET10）;AtSWEET1對應CmSWEET1a和CmSWEET1b;AtSWEET10對應CmSWEET10a和CmSWEET12c兩個基因;AtSWEET5對應CmSWEET15b和CmSWEET17a兩個基因。因此，我們認為中國南瓜SWEET基因與印度南瓜的進化關系相對擬南芥進化關系更加緊密，中國南瓜SWEET基因在葫蘆科的多倍化事件中得到了擴張。

3 討論與結論

SWEET基因家族在植物界廣泛分布，并參與許多重要的生理和生化過程（Yuan & Wang， 2013;Chen， 2014;Chandran， 2015;Eom et al.， 2015;Patil et al.， 2015）。然而，僅在基因組水平上鑒定了SWEET基因家族的少數物種，如擬南芥、水稻、番茄和大豆（Chen et al.， 2010;Yuan et al.， 2014;Feng et al.， 2015;Patil et al.， 2015）。據我們所知，迄今為止尚未有關葫蘆科南瓜屬作物的SWEET基因家族的系統研究報告。本研究中，我們通過分析中國南瓜的系統發育、染色體分布、基因結構、保守基序、順式作用調控元件等，探索了中國南瓜中的21個SWEET基因。

基因復制，包括片段復制、串聯復制和全基因組復制，他們在生物的進化過程中起重要作用（Xu et al.， 2012）。中國南瓜在經歷了核心真雙子葉植物共同的六倍體（core-eudicot common hexaploidization， ECH）事件（115～130百萬年前） （Jaillon et al.， 2007;Jiao et al.， 2011）后，又經歷了葫蘆科共有的全基因組加倍（cucurbit-common tetraploidization， CCT）事件的證據（Wang et al.， 2018），而后南瓜屬共享一次最近的全基因組加倍事件CST[古多倍體事件（Cucurbita-specific tetraploidization， CST）]（于繼高等，2020）。在中國南瓜中發現4對SWEET共線基因對， 有一對復制基因（CmSWEET10b-CmSWEET10a），由于這兩個基因不在同一條染色體上，因此我們認為是片段復制基因對。由Ka/Ks<1可知，中國南瓜SWEET基因正在進行純化正向選擇。

通過對中國南瓜和擬南芥SWEET蛋白進行系統發育樹分析，發現他們被分配到4個亞族，這一分類與先前擬南芥的分類一致（Hu et al.， 2017）。將中國南瓜和印度南瓜SWEET蛋白進行系統發育樹分析，發現每一個大分支都含有中國南瓜和印度南瓜SWEET蛋白，這表明中國南瓜和印度南瓜在進化上可能來自同一個祖先。

通過SWEET基因結構分析，發現同一亞族中的大多數基因在或外顯子數目或內含子數量方面具有相似的結構特征，這一現象與先前其他物種中SWEET家族結構特征相似（Yuan et al.， 2014;Feng et al.， 2015）。然而，同一個亞族中的CmSWEET17a和CmSWEET17b，與同一亞族中的其他CmSWEETs相比，它們含有不同數量的外顯子，這說明中國南瓜SWEET基因家族的結構多樣性。就特定的序列基序而言，在不同的亞族之間也檢測到高度差異。然而，在一個共同的亞族中，大多數中國南瓜SWEET蛋白具有保守的基序，這表明同一亞族可能具有相似的功能。

本研究發現，21個CmSWEETs基因啟動子序列中的植物激素順式元件和脅迫響應相關。在所有的CmSWEETs基因啟動子中，至少發現了2個與植物激素響應有關的順式作用元件，這意味著相應的激素可能在其調節中起著重要作用。此外，所有CmSWEETs基因至少包含一個應激相關的順式作用元件，表明這些基因在應激響應中也起著重要的調控作用。然而，還需要進一步地研究來確定這些順式元件是否以及如何在中國南瓜中起作用。

在中國南瓜中發現21個CmSWEETs，在印度南瓜中發現19個CmaSWEETs。Hu et al.（2017）在黃瓜中發現17個CsSWEETs。中國南瓜、印度南瓜與黃瓜都是密切相關的，雖然黃瓜有7條染色體，中國南瓜和印度南瓜都有21條。詳細的共線基因對和進化關系分析揭示了葫蘆科三種重要作物染色體進化和重排的高度復雜性。因此，黃瓜、中國南瓜和印度南瓜中SWEET基因的相似性水平特別高，這些同源的SWEET基因可能具有相似的功能。

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（責任編輯 蔣巧媛）