水稻SSR分子檢測與田間種植鑒定結果的差異分析

王亞清 丁顯萍 張萍

摘 要：以品種綠優1號、徽兩優882、銀兩優851共266個批次種子為研究對象，采取SSR分子標記技術和田間種植鑒定2種測純方法，對2種方法的結果進行差異性和相關性分析。結果表明：2種鑒定方法間差異不顯著，并具有一定的相關性，相關系數R分別為0.424（綠優1號）、0.387（徽兩優882）、0.397（銀兩優851），說明SSR分子標記鑒定方法可用于雜交稻種子純度的快速鑒定。研究結果對于快速了解雜交水稻種子質量狀況、保證用種安全和促進優質種子提前上市具有重要意義。

關鍵詞：水稻;SSR分子標記;正季鑒定;純度;差異分析

中圖分類號 Q789;S511文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）04-0082-02

種子質量是種子企業的生命，種子純度則是水稻種子質量的核心指標。傳統的田間小區種植鑒定是國家標準規定的、目前鑒定雜交水稻種子純度應用最廣泛的方法，也是目前公認最準確、最可靠的方法。唐海燕等[1]對192份雜交稻種子樣品的純度進行了田間種植鑒定，并對鑒定結果進行了分析研究。隨著分子標記技術的不斷發展和雜交新品種的不斷涌現，種子純度鑒定進入了基因水平，目前應用較為廣泛的是SSR分子標記。SSR分子標記技術具有重復性好、穩定性高、成本較低和易于操作等優點，利用SSR技術進行種子純度鑒定已成為一項重要的手段。吳則東等[2]概述了AFLP、ISSR、SRAP、SSR 等4種主要的分子標記技術在農作物品種鑒定上的研究進展，提出了SSR將是未來利用分子標記技術鑒定品種純度以及品種DUS測試的首選分子標記技術。王慧等[3]研究了不同世代恢復系所配雜交種種子室內分子鑒定與田間種植鑒定純度結果的吻合度。結果表明：當恢復系完全純合時，可用室內SSR分子標記鑒定替代田間種植鑒定來鑒定其雜交種的純度。筆者選取安徽荃銀高科種業股份有限公司3個品種3年入庫樣品共計266批次種子，探討了水稻品種的SSR標記技術與田間正季鑒定2種純度檢測結果的相關性和差異性，以期為雜交水稻種子純度鑒定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料 F1代材料：2018—2020年入庫的種子，其中，綠優1號235批、徽兩優882 13批、銀兩優851 18批，分別來自福建、貴州、四川、江西、江蘇等5個制種基地。化學試劑：Tris-HCL、乙酸銨、10% SDS、EDTA、乙醇、6%聚丙烯酰胺、5×TBE、10%AP、TEMED、AgNO3、NaOH、甲醛等。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間鑒定 選擇水源充足、排灌方便、肥力中等、形狀規則、光照條件好的田塊作為鑒定田。每個批次按照國家標準鑒定400株，在種子收后次年4月中下旬播種，5月中下旬移栽，8月上中旬進行鑒定。此鑒定時期、鑒定小區的植株基本與大田生產種植植株的生育期進程處于同一時期。采用人工觀察統計的方法分別在抽穗揚花期、成熟期進行鑒定，記錄父本、母本、保持系以及其他雜株類型。

1.2.2 SSR分子標記 DNA的提取：剪取1～2cm長的種子幼苗，冷凍后利用球磨儀進行研磨，采用張雯等[4]優化后的DNA提取法分別提取綠優1號、徽兩優882、銀兩優851共計266批次種子的DNA備用。引物的篩選：根據中華人民共和國農業行業標準NY/T1433—2014公布的48對引物，分別對3個品種篩選出2對引物，綠優1號：RM583和RM471;徽兩優882：RM339和RM3331;銀兩優851：RM471和RM481。PCR體系配比（10μL）：DNA模板1μL，上游引物0.25μL，下游引物0.25μL，Mix 5μL，ddH2O 3.5μL。PCR反應程序：94℃預變性2min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，進行30次擴增反應循環，10℃恒溫保存。電泳和染色：采取非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染[5]。

1.3 數據處理 數據利用Excel進行卡方（χ2）分析。

χ2=∑（|分子測純-正季鑒定|）2/正季鑒定

2 結果與分析

2.1 2種不同鑒定方法結果的差異性 由表1可知，銀兩優851種子的純度最好，合格率均為94.4%;綠優1號和徽兩優882種子的純度合格率均是正季鑒定高于分子鑒定;3個品種的χ2計算分析，綠優1號：χ2=27.287<χ20.05，100=124.34<χ20.05，234，P>0.05;徽兩優882：χ2=0.414<χ20.05，12=21.03，P>0.05;銀兩優851：χ2=10.085<χ20.05，17=27.59，P>0.05;表明3個品種種子的分子鑒定結果與正季鑒定結果差異均不顯著。由此可見，SSR分子標記鑒定方法用于綠優1號、徽兩優882、銀兩優851這3個品種種子純度鑒定均具有可靠性。

2.2 2種不同鑒定方法結果的相關性 對3個品種的正季鑒定和SSR分子測純結果分別作相關性分析。相關系數R>0表示2變量存在正的線性關系;R<0表示負的線性關系;|R|>0.8表示具有較強的線性相關關系;|R|<0.3表示具有較弱的線性相關關系。由圖1、2、3可知，綠優1號、徽兩優882和銀兩優851的正季鑒定結果與SSR分子鑒定結果均呈正相關，其中綠優1號的相關系數R為0.424，徽兩優882的相關系數R為0.387，銀兩優851的相關系數R為0.397，均說明這2種鑒定方法具有相關性。

3 結論與討論

試驗結果表明：3個品種種子純度2種方法的鑒定結果均表現出正相關性，且R均>0.3，說明SSR分子鑒定結果與正季鑒定結果存在相關關系，這與陽慶華等[6]研究結果一致。SSR分子鑒定結果與正季鑒定結果雖然存在差異，但差異并不顯著。主要原因在于其他品種串粉田間雜株多，其籽粒性狀和植株生育期都與真品種較為接近，難以分辨;另外，田間環境和人為因素可能會造成影響。這表明了分子標記更易區分真雜種子，而田間正季鑒定難以區分相似的雜株。因此SSR分子標記鑒定方法可用于雜交稻品種純度的快速鑒定，這與陳年偉等[7]研究結果一致。

參考文獻

[1]唐海燕，嚴欽泉，嚴秋平.雜交水稻種子純度田間種植鑒定的結果與分析[J].雜交水稻，2005（3）：38-42.

[2]吳則東，江偉，馬龍彪.分子標記技術在農作物品種鑒定上的研究進展及未來展望[J].中國農學通報，2015，31（33）：172-176.

[3]王慧，張從合，陳金節，等.基于NY/T 1433—2014推薦SSR標記檢測不同世代恢復系配制雜交種的純度研究[J].雜交水稻，2019，34（2）：59-62.

[4]張雯，丁顯萍，張萍，等.雜交水稻種子純度DNA指紋鑒定與田間鑒定結果的比較[J].安徽農學通報，2018，24（13）：11-12.

[5]任輝.SSR分子標記在雜交水稻品種純度鑒定中的應用研究[D].杭州：浙江農林大學，2013.

[6]陽慶華，李秀瓊，魯孟海.SSR分子檢測與田間小區種植鑒定揚兩優6號純度的比較[J].中國種業，2014（7）：49-50.

[7]陳年偉，張體剛，徐昌能，等.SSR分子檢測與田間種植鑒定雜交稻種子純度的研究[J].西南農業學報，2009，22（3）：553-555.

（責編：徐世紅）