特征圖譜結合模式識別方法在半邊蓮質量控制中的應用

曾慧芬，賈 磊，麥 曦，李 娜，陳 葶，李 健

(南昌大學藥學院，南昌 330006)

中藥化學成分復雜，多成分、多靶點的作用特性使其同時具有多種藥用價值，僅從單一成分入手難以表征其質量特性。中藥指紋圖譜作為一種綜合的、整體的中藥質量控制技術，已得到廣泛應用，該技術能綜合反映中藥質量，具有分析快速、分離效能高、應用設備普遍等優點[1]。中藥特征圖譜是在指紋圖譜基礎上提取出典型的共有特征峰進行中藥質量控制的技術，該技術既有指紋圖譜綜合評價的優點又兼顧了中藥來源的多變性和復雜性，強調的是中藥的典型特征成分，而非全部成分，較指紋圖譜更加符合中藥的具體實際情況[2-3]。模式識別能根據大批樣品的分析數據進行分類研究，常用的方法有主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判別分析(PLSDA)及正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)等。將模式識別方法與中藥特征圖譜結合，能快速而有效地處理數據并挖掘出有價值的信息，從而能更好地控制中藥質量[4-6]。

半邊蓮為桔梗科植物半邊蓮的干燥全草，始見于《滇南本草》，后在李時珍所著的《本草綱目》中也有詳細記載，性辛、平，歸心、肺、小腸經，為清熱解毒、利尿消腫之良品[7-8]。半邊蓮在我國分布廣泛，屬于臨床常用中藥材，其質量標準現收載于2015年版《中國藥典》[9]，但其僅對半邊蓮的性狀、水分和浸出物等進行質量控制，很難保證該藥材的質量。文獻[10]對產自安徽、江蘇、浙江、湖北及廣西的10批半邊蓮建立了指紋圖譜，采用中藥指紋圖譜相似度軟件進行相似度的評價，發現即使是產地相同的半邊蓮藥材相似度也存在較大差異。因此，有必要更廣泛地收集全國各產地的半邊蓮藥材進行深入研究，以完善其質量控制方法。本工作收集了全國各產地的半邊蓮藥材和半邊蓮飲片(共48批)，建立特征圖譜，并進行了特征峰的歸屬和鑒定，還采用模式識別方法對48批樣品的特征圖譜進行數據擬合分析，建立了有效判別模型，能對半邊蓮藥材和半邊蓮飲片進行分類，并確定出半邊蓮中的香葉木苷和蒙花苷對半邊蓮藥材和半邊蓮飲片的分類貢獻較大，從而對這2個組分建立了測定方法，為半邊蓮的質量控制提供了方法基礎和依據。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AD 型二元泵高效液相色譜儀，配DGU-20A3型真空在線脫氣機、SIL-20A 型自動進樣器、SPD-20A 型二極管陣列檢測器；KQ-250B型超聲波清洗器。

香葉木苷和蒙花苷混合標準溶液:含8.000 mg·L－1香葉木苷和4.000 mg·L－1蒙花苷，稱取適量的香葉木苷和蒙花苷，用適量二甲基亞砜(DMSO)溶解并用甲醇稀釋而成。

香葉木苷對照品的純度不小于98%；蒙花苷對照品的純度不小于96.6%；甲醇為色譜純；試驗用水為純凈水。

1.2 色譜條件

Inertsil-ODS 3-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱溫25 ℃；進樣量10μL；流量1.0 mL·min－1；檢測波長360 nm。流動相:A 為甲醇，B 為水。梯度洗脫程序:0～8 min 時，A 由40%升至45%；8～15 min 時，A 由45%升至60%；15～22 min時，A 由60%升至65%；22～30 min時，A由65%升至70%；30～40 min 時，A 由70%升至75%；40～45 min時，A 由75%降至40%。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

24批半邊蓮藥材(S1～S24)產自湖南、福建、江西、安徽、四川、貴州、江蘇、浙江、廣東、廣西、湖北等11個產地；24批半邊蓮飲片(Y1～Y24)由江西、貴州、河北、浙江、河南、安徽、廣西、四川、海南等地的18個飲片生產企業生產。

將半邊蓮藥材或半邊蓮飲片研磨后過0.25 mm(4號)篩，稱取半邊蓮粉末樣品約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%(體積分數，下同)甲醇溶液25 mL，密塞，稱定質量，超聲提取(功率250 W，頻率40 k Hz)30 min，冷卻至室溫。再次稱定質量，用70%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續濾液按色譜條件進行測定。

1.3.2 數據處理

將48批半邊蓮樣品在波長360 nm 處測得的色譜數據導出，采用Excel軟件進行峰對齊處理，將數據導入SIMCA-P 13.0軟件，采用自動標度化程序進行預處理后用于模式識別。首先采用PLS-DA程序進行數據分析，然后采用OPLS-DA 程序使數據(峰強度)和響應變量(預測分類)的協方差最大化。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

試驗考察了甲醇-0.2%(體積分數)磷酸溶液體系、乙腈-水體系和甲醇-水體系作為流動相時梯度洗脫的效果。結果表明:采用甲醇-水體系進行梯度洗脫時，色譜峰分離度較好，響應值較高，基線平穩。試驗選擇流動相為甲醇-水體系。

試驗通過二極管陣列檢測器在190～400 nm進行全波長掃描，考察了檢測波長依次為249，254，308，360 nm 時的色譜峰形態。結果表明:檢測波長為360 nm 時，色譜峰形態較好且基線平穩，主要色譜峰分離度好，干擾峰較少。試驗選擇檢測波長為360 nm。

2.2 提取方法的選擇

試驗考察了減壓濃縮、加熱回流以及不同溶劑超聲等提取方法對半邊蓮特征峰出峰情況的影響。結果表明:提取方法為減壓濃縮及加熱回流時，樣品中各目標成分響應值相差較大，色譜峰多而雜，分離度不好；樣品采用70%甲醇溶液超聲提取30 min后，獲得的色譜峰數量和強度適宜，且分離度較好。試驗選用70%甲醇溶液超聲提取樣品30 min。

2.3 特征峰和參照物峰的指認

分別取不同產地的半邊蓮藥材和半邊蓮飲片共37批，按試驗方法進行分析，得到其特征圖譜，發現半邊蓮有5個共有特征峰。

半邊蓮對照品的特征圖譜見圖1。

將半邊蓮對照品的特征圖譜數據與多個香葉木苷對照品、蒙花苷對照品等的圖譜數據進行比較，確定1號峰和3號峰分別為香葉木苷和蒙花苷，其中蒙花苷峰保留時間適中，與鄰近峰的分離度良好，可將其作為參照物峰。計算各特征峰與參照物峰的相對保留時間作為特征參數。

2.4 樣品特征圖譜測定及模式識別分析

按試驗方法測定48 批樣品(S1～S24，Y1～Y24)的特征圖譜，將特征圖譜數據導入SIMCA-P 13.0軟件，啟動PLS-DA 程序，擬合提取得到4 個主成分，能說明85.3%的X變量和88.7%的Y變量的變化，擁有49.8%的預測能力，模型的預測能力不好。在軟件中繼續啟動OPLS-DA 程序，擬合提取得到4 個主成分，能說明85.3%的X變量和88.7%的Y變量的變化，擁有75.9%的預測能力，表明建模成功，可用于半邊蓮特征圖譜的模式識別。

OPLS-DA 程序擬合分析的得分散點圖見圖2。

圖2 OPLS-DA 程序擬合分析的得分散點圖Fig.2 Score scatter plot of fitting analysis by OPLS-DA program

由圖2可知:除S7和Y17外，46個批次的半邊蓮樣品的數據點均落在95%的置信區間內；飲片組中Y1較接近藥材組，其他藥材和飲片各自聚集，且明顯區分開，說明半邊蓮藥材和半邊蓮飲片的特征圖譜存在一定差異。

S7和Y17為在95%置信區間外的異常值，提示二者的特征圖譜存在不同之處。將Y1、S7 和Y17進行標記后，提取三者的圖譜與正常組分S1進行比較，樣品(S1、Y1、S7和Y17)的特征圖譜見圖3。

圖3 樣品(S1、Y1、S7和Y17)的特征圖譜Fig.3 Characteristic chromatograms of the samples(S1，Y1，S7 and Y17)

由圖3可知:S7的特征峰5的響應值較大，Y17的特征峰4的響應值較大，異于其他批次樣品從而造成差異。

飲片Y1介于藥材組和飲片組之間，或許兼具藥材組和飲片組的共性。從得分散點圖的距離及特征圖譜的比較來看，Y1靠近S1，S1的半邊蓮藥材產于湖南攸縣，Y1 的半邊蓮飲片的產地為湖南懷化，Y1與S1相近的原因或許與這兩批半邊蓮的產地相近從而成分相近有關。

篩選變量重要性值大于1的成分，5個特征峰的變量重要性值依次如下:香葉木苷為3.14，蒙花苷為1.98，峰2為1.89，峰4為0.41，峰5為0.16。香葉木苷和蒙花苷這兩個組分對半邊蓮藥材和半邊蓮飲片的分類貢獻較大，提示應對這兩個已知組分建立質量控制方法，需建立香葉木苷和蒙花苷含量的測定方法。

2.5 標準曲線和檢出限

按色譜條件對含0.399 7，1.998，7.993，11.99，19.98，39.97 mg·L－1香葉木苷和0.185 5，0.927 6，3.711，5.566，9.277，18.55 mg·L－1蒙花苷的混合標準溶液系列進行測定，以香葉木苷和蒙花苷的質量為橫坐標，對應的色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

香葉木苷和蒙花苷的線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表1。

根據3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)，結果見表1。

表1 線性范圍、線性回歸方程、相關系數和檢出限Tab.1 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.6 精密度和回收試驗

按色譜條件對香葉木苷和蒙花苷混合標準溶液連續進樣6次，測定香葉木苷和蒙花苷峰面積的相對標準偏差(RSD)，結果分別為0.47%，1.4%，儀器精密度良好。

按試驗方法對同一批次半邊蓮粉末樣品進行分析，平行測定6次，并進行加標回收試驗，計算回收率和測定值的RSD，結果見表2。

表2 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 穩定性試驗

按色譜條件將香葉木苷和蒙花苷混合標準溶液分別于0，2，4，8，12，24 h進樣測定。結果表明:香葉木苷、蒙花苷峰面積的RSD 分別為1.2%，1.8%。這表明香葉木苷和蒙花苷混合標準溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 樣品分析

按試驗方法對半邊蓮藥材樣品和半邊蓮飲片樣品進行分析，結果見表3。

表3 樣品分析結果Tab.3 Analytical results of the samples

表3 (續)

由表3可知:半邊蓮藥材中香葉木苷的質量分數為0.225 8～0.381 6 mg·g－1，平均值為0.322 1 mg·g－1，蒙花苷的質量分數為0.036 15～0.308 6 mg·g－1，平均值為0.077 96 mg·g－1；半邊蓮飲片中香葉木苷的質量分數為0.218 6～0.369 9 mg·g－1，平均值為0.291 9 mg·g－1，蒙花苷的質量分數為0.031 01～0.137 5 mg·g－1，平均值為0.059 26 mg·g－1。半邊蓮藥材中香葉木苷和蒙花苷的含量均高于半邊蓮飲片中香葉木苷和蒙花苷的含量，或許這是造成半邊蓮藥材和半邊蓮飲片分類差異的原因之一。雖然S7和Y17為模式識別分析中的異常值，但兩者的香葉木苷和蒙花苷含量無異常之處，可見這兩批樣品與其他樣品的差異不是由香葉木苷和蒙花苷的含量差異造成的，而主要是由特征峰4和特征峰5的較大差異造成的。

本工作采用高效液相色譜法建立了半邊蓮的特征圖譜，其具有5個典型特征峰，其中的1 號峰和3號峰分別為香葉木苷和蒙花苷。通過模式識別方法對48批半邊蓮樣品建立OPLS-DA 模型，該模型能夠成功區分半邊蓮藥材和半邊蓮飲片，并發現其中的差異樣品，通過對差異樣品進行標記和提取相關圖譜進行比較，揭示了產生差異的原因。篩選變量重要性值大于1的成分，香葉木苷和蒙花苷對半邊蓮藥材和半邊蓮飲片的分類貢獻較大，因此建立了香葉木苷和蒙花苷的含量測定方法，全面測定48批半邊蓮樣品中香葉木苷和蒙花苷的含量。半邊蓮飲片中香葉木苷和蒙花苷的含量均低于半邊蓮藥材中香葉木苷和蒙花苷的含量，這或許是造成半邊蓮藥材和半邊蓮飲片分類差異的原因之一。本方法為半邊蓮的鑒定及質量評價提供了科學依據，對半邊蓮質量標準的提高有積極意義。