液相色譜-串聯質譜法測定護膚類化妝品中5種棕櫚酰多肽

(廣州質量監督檢測研究院，廣州 510110)

多肽在化妝品中的使用已有20 多年，僅2017年國內與多肽相關的化妝品行業市場規模已經達到34.02億元，產量約81.5 t[1-4]。生物活性多肽來源于皮膚中主要胞外蛋白的酶解，可調節膠原蛋白、彈性蛋白和黑色素的合成，有廣譜的抗微生物活性，被應用于應對皮膚老化和光老化、傷口愈合等問題。在生物活性多肽中引入酯基團可極大地增進其透膚性[5-7]。來源于細胞因子的棕櫚酰三肽-1、棕櫚酰五肽-3、棕櫚酰四肽-7和棕櫚酰六肽-12均被證明具有促進膠原蛋白合成，改善皮膚老化的效果[6-11]。棕櫚酰五肽-3、棕櫚酰三肽-5 是合成信號多肽，可激活組織生長因子(TGF-β)，促進膠原蛋白合成[6，12-13]。因此，棕櫚酰多肽作為護膚類化妝品的功效原料被使用。

生物活性多肽的測定方法多為質譜法。文獻[14]建立了雞湯中的肌肽和鵝肌肽測定方法，方法采用反相吸附劑材料去除雞湯中的鹽，采用液相色譜-串聯質譜法測定目標物。文獻[15]建立了化妝品中多肽的測定方法，樣品加入氯化鈉和乙酸后，用甲醇提取，采用液相色譜-串聯質譜法測定目標物。文獻[16]建立了化妝品中寡肽-20 和寡肽-24 的測定方法，樣品經乙腈-甲酸銨緩沖鹽溶液提取后用液相色譜-質譜法測定目標物。文獻[17]建立了測定化妝品中六肽的基質輔助激光解吸-質譜法。

本工作采用液相色譜-串聯質譜法測定護膚類化妝品中棕櫚酰五肽-3、棕櫚酰四肽-7、棕櫚酰三肽-1、棕櫚酰三肽-5、棕櫚酰六肽-12等5種棕櫚酰多肽的含量，方法的建立對化妝品質量監管具有重要意義。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000-TSQ Quantiva 型液相色譜-串聯質譜儀；Minishaker MS3 digital型渦旋混合儀；SK 8200H 型超聲波清洗儀；Mill-Q 型超純水儀。

棕櫚酰五肽-3、棕櫚酰四肽-7和棕櫚酰三肽-1的標準儲備溶液:1.00 g·L－1，分別稱取適量的棕櫚酰五肽-3、棕櫚酰四肽-7和棕櫚酰三肽-1的標準品于10 mL容量瓶中，用80%(體積分數，下同)甲醇溶液定容，搖勻，于4 ℃存放。

棕櫚酰三肽-5和棕櫚酰六肽-12的標準儲備溶液:1.00 g·L－1，分別稱取適量的棕櫚酰三肽-5和棕櫚酰六肽-12的標準品于10 mL 容量瓶中，用乙醇定容，搖勻，于4 ℃存放。

5種棕櫚酰多肽的混合標準溶液:20.0 mg·L－1，分別移取適量的5 種棕櫚酰多肽的標準儲備溶液于10 mL容量瓶中，用90%甲醇溶液定容，搖勻，于4 ℃存放。

提取劑:含0.1 mol·L－1乙酸銨的95%甲醇溶液。

棕櫚酰五肽-3標準品和棕櫚酰四肽-7 標準品的純度均為94%，棕櫚酰三肽-1和棕櫚酰三肽-5標準品的純度均為93%，棕櫚酰六肽-12標準品的純度為91%。

甲醇、乙醇、乙腈、乙酸均為色譜純；乙酸銨為分析純；試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 LIChrospher?60RP-select B色譜柱(4.6 mm×150 mm，5μm)；流量1.0 mL·min－1；進樣體積5μL。流動相:A 為含0.3%(體積分數，下同)乙酸的50 mmol·L－1乙酸銨溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序:0～6 min時，B 由50%升至65%；6～7 min時，B由65%升至95%，保持3 min；10～11 min時，B由95%降至50%，保持5 min。

2)質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，負離子模式和正離子模式；噴霧電壓3 000 V；氣化器溫度320℃，傳輸管溫度325℃；選擇反應監測(SRM)模式。其余質譜參數見表1。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

對于乳液樣品和膏霜樣品，稱取約0.2 g樣品于刻度管中，用提取劑定容至10.0 mL，渦旋0.5 min，超聲提取20 min，取出冷卻至室溫。提取液經濾膜過濾后，取濾液按儀器工作條件進行測定。

對于水劑樣品，稱取約0.2 g樣品，用提取劑定容至5.0 mL，渦旋混勻。提取液經濾膜過濾后，取濾液按儀器工作條件進行測定。

1.3.2 結果計算

樣品中目標物含量按公式(1)計算:

式中:w為目標物的質量分數，mg·kg－1；ρ為樣品分析結束后根據標準曲線計算得到的目標物的質量濃度，μg·L－1；V為定容體積，m L；m為稱樣量，g。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按儀器工作條件對200.0μg·L－1的5種棕櫚酰多肽的混合標準溶液進行測定，5種棕櫚酰多肽混合標準溶液的色譜圖見圖1。

2.2 儀器工作條件的選擇

因為棕櫚酰多肽具有一定的離子性，所以棕櫚酰多肽尤其是棕櫚酰五肽-3、棕櫚酰三肽-1、棕櫚酰三肽-5在常規的C18色譜柱中有拖尾效應，即使采用50 mmol·L－1乙酸銨溶液作為流動相的水相，拖尾效應仍較嚴重。耗材調研發現:LIChrospher?60RP-select B 堿性化合物分析專用色譜柱的鍵合相為改性C8疏水基團，孔徑6 nm，可以大大降低表面硅醇基團暴露在流動相中的幾率，改善堿性化合物的拖尾效應。試驗選用LIChrospher?60RP-select B色譜柱。

試驗考察了流動相的水相依次為0，10，20，50，100 mmol·L－1乙酸銨溶液時對5種棕櫚酰多肽測定的影響。結果表明:乙酸銨的濃度為50，100 mmol·L－1時，5 種棕櫚酰多肽的拖尾效應很弱，但是乙酸銨溶液濃度為100 mmol·L－1時，5種棕櫚酰多肽的響應顯著降低。試驗選擇乙酸銨的濃度為50 mmol·L－1。試驗還考察了50 mmol·L－1乙酸銨溶液中乙酸的體積分數依次為0，0.1%，0.2%，0.3%時對5種棕櫚酰多肽測定的影響。結果表明:乙酸的體積分數為0.3%時，5種棕櫚酰多肽的響應最大，且信噪比得到了很大的改善。試驗選擇乙酸的體積分數為0.3%。試驗選擇流動相的水相為含0.3%乙酸的50 mmol·L－1乙酸銨溶液。

圖1 5種棕櫚酰多肽混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution of 5 palmitoyl polypeptides

對流動相的梯度洗脫程序進行了適度優化后，試驗選擇的梯度洗脫程序見1.2節。在此梯度洗脫程序下，5 種棕櫚酰多肽的峰形尖銳，峰寬約0.2 min。

化合物母離子的離子源條件通過TSQ Quantiva 2.0 Tune軟件人工優化得到，子離子選擇和碰撞電壓通過TSQ Quantiva 2.0 Tune軟件自動優化得到，試驗選擇的質譜條件見1.2節。

2.3 提取劑的選擇

棕櫚酰多肽在高含量的甲醇溶液中有較高的溶解度，且高含量的甲醇溶液可以將膏霜樣品和乳液樣品中常含有的黃原膠等膠質沉淀下來，避免膠質堵塞濾膜或色譜柱。在提取劑中加入乙酸銨可以更好地促進棕櫚酰多肽的溶解，避免濾膜和儀器管路阻隔造成的吸附損失。試驗采用的提取劑(含0.1 mol·L－1乙酸銨的95%甲醇溶液)既含有乙酸銨又含有高含量的甲醇。

2.4 基質效應

分別采用提取劑和空白基質(乳液、膏霜)配制20.0μg·L－1的5種棕櫚酰多肽的混合標準溶液，按儀器工作條件進行測定。用空白基質混合標準溶液中化合物的響應與提取劑混合標準溶液中對應化合物的響應的比值表示基質效應，5種棕櫚酰多肽的基質效應見表2。

表2 5種棕櫚酰多肽的基質效應Tab.2 Matrix effect of 5 palmitoyl polypeptides

由表2可知:基質效應可以忽略。

2.5 標準曲線和測定下限

移取適量的5種棕櫚酰多肽的混合標準溶液，用提取劑稀釋，配制成0，2.0，4.0，10.0，20.0，40.0，100.0，200.0μg·L－1的混合標準溶液系列。按儀器工作條件對上述混合標準溶液系列進行測定，并繪制標準曲線。結果表明:5種棕櫚酰多肽的質量濃度均在2.0～200.0μg·L－1內與其對應的峰面積呈線性關系，線性回歸方程和相關系數見表3。

根據10倍信噪比計算方法的測定下限(10S/N)，結果為2.0μg·L－1。

表3 線性回歸方程和相關系數Tab.3 Linear regression equations and correlation coefficients

2.6 準確度和精密度

按試驗方法對水劑、乳液、膏霜等3種空白護膚類化妝品樣品進行加標回收試驗，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結果見表4。

由表4可知:回收率為89.4%～111%，RSD 為1.1%～10%，方法的準確度和精密度較好。

加標空白膏霜樣品的色譜圖見圖2。

2.7 樣品分析

按試驗方法對7批廣州某品牌護膚類化妝品樣品進行分析，樣品中均未檢出5種棕櫚酰多肽。

表4 準確度和精密度試驗結果(n＝6)Tab.4 Results of tests for accuracy and precision(n＝6)

本工作建立了液相色譜-串聯質譜法測定護膚類化妝品中5種棕櫚酰多肽的分析方法。方法操作簡便，測定結果準確可靠，適用于護膚類化妝品中5種棕櫚酰多肽含量的測定。本方法可為國內化妝品行業的產品研發和產品質量控制提供重要技術支撐，對護膚類化妝品中其他棕櫚酰多肽產品的分析有一定的參考意義，具有較好的應用前景。

圖2 加標空白膏霜樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank cream sample mixed with standards