復方麝香膏治療外陰硬化性苔癬的臨床療效及對細胞周期蛋白D1、抑癌基因p16表達的影響

外陰硬化性苔癬是由慢性淋巴細胞介導的最常見的外陰白色病變，好發于外陰、肛周，主要表現為皮膚萎縮伴黏膜色素脫失。其發病機制尚不清楚，是一種難治性婦科疾病，目前臨床治療方法主要包括聚焦超聲、藥物、激光及手術治療等。激光治療不能到達真皮層，僅局限于淺層，療效有限；聚焦超聲是近年來新興物理治療，見效快，但容易引起皮膚紅腫及熱損傷，且復發率高；而手術創傷較大，病人不易接受，且復發率高，并不作為首選。本研究通過應用復方麝香膏以局部涂抹藥物的方式局部治療，并與傳統藥物進行對比，探討復方麝香膏治療外陰硬化性苔癬的臨床療效及相關機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年6月至2019年6月廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院婦科門診經病理活檢確診為外陰硬化性苔癬的90例病人，按隨機數字表法分為兩組：觀察組45例，年齡（45.45±7.27）歲，范圍為39～63歲；病程（4.16±0.47）年，范圍為0.55～8.00年；對照組45例，年齡（46.11±6.84）歲，范圍為38～65歲；病程（4.04±0.53）年，范圍為0.65～7.80年；兩組年齡、病程比較，均差異無統計學意義（

P

＞0.05）。

1.2 選取標準

納入標準：符合西醫的診斷標準，暫無生育要求的女性；經病理診斷確診；無糖尿病，無嚴重的心腦血管、肝腎疾病，并排除造血系統疾病所致陰癢者；排除泌尿、生殖道感染所致外陰瘙癢者；本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。排除標準：外陰病理活檢為外陰上皮內瘤樣改變及外陰癌；滴蟲、霉菌等感染性外陰炎；由糖尿病所致外陰病變；孕婦及哺乳期；依從性較差；對相關藥物及治療過敏；正在參加其他藥物臨床試驗。

1.3 治療方法

對照組：2%丙酸睪酮（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號H33021205，批次201718）50 mg 4支，1%丁酸氫化可的松軟膏10 g∶10 mg 1支（北京優華藥業有限公司，批號H20093828，批次20170102），凡士林10 g，混勻后均勻涂薄層0.2 mm于病變處，每天2次，治療3個月為1個療程，門診定期隨訪。并于治療后即刻及治療后6個月按評價標準判定療效。觀察組：采用該院科室協定處方復方麝香膏，藥物組成：麝香3 g，冰片10 g，龍血竭3 g，2%丙酸睪丸酮50 mg，凡士林10 g。方法同對照組。

1.4 組織病理學檢查方法

所有標本經10%甲醛固定后常規石蠟切片包埋（厚度為4μm）。蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡觀察。

1.5 免疫組化分析方法

細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、抑癌基因p16檢測方法：采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法。切片置于涂有黏合劑的玻片上，進行烘烤、脫蠟、乙醇脫水處理，水洗后浸泡于3%過氧化氫溶液中，隨后磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗。置入枸櫞酸鹽緩沖液中，使用PBS沖洗。加一抗，室溫孵育后沖洗。加入二抗，靜置后PBS沖洗。用過氧化氫-二氨基聯苯胺顯色，水洗。蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂膠封固后進行光鏡檢查。免疫組化結果判定參照文獻的標準，陽性：細胞核、細胞質內出現棕褐色染色。陽性細胞分4級：不著色為陰性（-）；淺黃色、無明顯有色顆粒，陽性細胞數＜10%者為弱陽性（+）；棕色細顆粒，陽性細胞數為10%～50%者為中度陽性（++）；深棕褐色粗大顆粒，陽性細胞數＞50%者為強（+++）。用已知陽性乳腺癌組織切片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。最終判定標準：（-）記為陰性，（+）、（++）、（+++）記為陽性。

1.6 療效評定標準

痊愈：無瘙癢癥狀，病變區域皮膚黏膜顏色、彈性恢復正常，病變面積縮小超過2/3或未見明顯病變，病理檢查為正常皮膚；顯效：外陰瘙癢癥狀基本消失，病變區域皮膚顏色呈現粉紅，彈性好轉，病變面積縮小約2/3，病理檢查接近正常；有效：外陰瘙癢癥狀部分減輕或緩解，皮膚組織顏色變為淡紅色，彈性略好轉，病變面積縮小約1/3，病理檢查部分恢復正常；無效：外陰瘙癢癥狀仍然存在，皮膚彈性、顏色、病變面積無明顯變化甚至擴大，病理檢查無明顯變化。總有效率=（痊愈+顯效+有效）/每組總數×100%。

1.7 統計學方法

利用SPSS 18.0版統計軟件對所得數據進行統計學分析，率的比較采用

χ

檢驗。

P

＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療前后病理變化結果

治療前兩組病理結果無明顯差異，主要表現：表皮層過度角化，棘細胞層變薄、萎縮，上皮腳變鈍或消失，黑色素細胞減少，可見真皮層炎性細胞浸潤。治療完成后即刻兩組病理結果基本一致：各型病變組織過度角化明顯減輕，外陰皮膚的表皮層逐漸恢復正常結構，黑色素細胞增多，炎性細胞浸潤減少。但治療后6個月與對照組比較，觀察組病變組織角化明顯減輕，外陰皮膚的表皮層黑色素細胞多，炎性細胞浸潤少。

2.2 免疫組化結果

與治療前比較，治療完成后即刻兩組cyclin D1蛋白陽性表達率均降低（

P

＜0.05），p16蛋白陽性表達率均升高（

P

＜0.05）；治療后6個月觀察組cyclin D1蛋白陽性表達率仍低于治療前（

P

＜0.05），p16蛋白陽性表達率高于治療前（

P

＜0.05），對照組cyclin D1及p16蛋白陽性表達率與治療前差異無統計學意義（

P

＞0.05）。治療完成后即刻兩組cyclin D1及p16蛋白陽性表達率均差異無統計學意義（

P

＞0.05）；治療后6個月，觀察組cyclin D1蛋白陽性表達率低于對照組（

P

＜0.05），p16蛋白陽性表達率高于對照組（

P

＜0.05）。見表1，2。

表1 兩組外陰硬化性苔癬組織中細胞周期蛋白D1（cyclin D1）蛋白陽性率的比較/例（%）

2.3 臨床療效評估

治療后，兩組總有效率相當（

P

＞0.05）。治療后6個月，觀察組總有效率高于對照組（

P

＜0.05）。見表3。

表2 兩組外陰硬化性苔癬組織中p16蛋白陽性率的比較/例（%）

3 討論

外陰硬化性苔癬是發生在女性外陰皮膚和黏膜的良性病變，常伴有外陰瘙癢及色素減退、皮膚彈性減弱，病程較長，容易復發，屬于皮膚和黏膜非瘤樣上皮病變，惡變率為2%～5%。目前臨床常規多采用糖皮質激素聯合丙酸睪丸酮治療本病，研究證實，糖皮質激素對溶酶體膜具有穩定及防止溶酶體釋放，減少炎癥介質的產生并降低毛細血管壁及細胞膜的通透性、抑制組胺形成與釋放的作用，進而控制局部瘙癢。而丙酸睪丸酮能使氨基酸分解減少，促進細胞分裂與生長，并維持其正常功能。糖皮質激素聯合丙酸睪丸酮是目前臨床治療的一個常規療法，療效肯定，但是糖皮質激素長期使用存在外陰萎縮，復發率高的問題。本研究中丙酸睪丸酮作為治療該病的基礎用藥，通過傳統藥物糖皮質激素與復方麝香膏的中藥成分對比，觀察病人臨床癥狀及體征、病理切片的變化判定療效，結果表明，兩組治療后臨床癥狀及體征均較治療前好轉，療效相當；而治療后6個月復方麝香膏治療效果優于對照組，療效穩定，說明復方麝香膏長期療效優于傳統激素療法。

外陰硬化性苔癬病理主要表現為表皮層過度角化和毛囊角質栓，上皮腳變鈍或消失，基底層細胞內及細胞間液化，黑色素細胞減少，真皮層炎性細胞浸潤，微血管數目減少。特殊染色可見彈力纖維消失，網狀纖維稀疏。本研究中觀察組與對照組治療后病理均有明顯好轉，治療后6個月觀察組病理改變優于對照組，觀察組病變組織角化較對照組明顯減輕，外陰皮膚的表皮層黑色素細胞多，而炎性細胞浸潤少，病理結果證實復方麝香膏長期療效優于對照組。

傳統中醫認為，硬化性苔癬病變屬于中醫“陰癢”范疇，多屬肝腎陰虛血瘀證，血虛則不能濡養陰部肌膚，則肌膚顏色減退或萎縮；血瘀則脈絡瘀阻，因此陰部瘙癢并皮膚增厚。本制劑的主要成分麝香之辛香能通諸竅之不利，有疏通脈絡、活血消腫之功，并使營養物質疏通至病變組織，因此對“陰癢”之證具有很好的濡養功效，促進陰部病變組織向正常組織分化。現代藥理研究表明，麝香外用可改善微循環，且容易被皮膚組織吸收，有助于組織修復及促進皮膚膠原纖維的形成，此外，麝香還有抗菌、抗炎的作用。血竭為本制劑復方麝香膏的另一重要成分，血竭具有性平，味甘、咸特點，無毒，外用能生肌斂瘡，祛瘀生新，有效改善病變組織微循環，是中藥外治中最常用的活血生肌藥物。硬化性苔癬病變病理表現為真皮層炎性細胞浸潤，微血管數目減少，而龍血竭中含有血竭皂苷和植物防衛素等多種活性成分，具有強大的抗炎鎮痛作用，植物防衛素為抗炎防腐物質，具有祛腐生肌的作用，石聰發現龍血竭可促進皮膚創面真皮層中毛細血管的增生，并具有修復創面的作用。冰片是復方麝香膏中又一重要成分，具有清熱解毒、抗炎的作用，因而廣泛用于局部皮膚制劑中。冰片性質辛散，能引藥由肌表直達腠理，清涼止癢。目前大量藥理研究證實冰片能不同程度地促進藥物的透皮吸收及促進黏膜吸收，冰片可促進麝香酮的胃腸吸收，冰片的作用時間越長，麝香酮的吸收越好。

表3 外陰硬化性苔癬治療后兩組臨床療效比較

復方麝香膏采用麝香、血竭與冰片結合，直接敷于患處，不僅促進局部組織血液循環，改善細胞通透性，促進藥物吸收，而且簡便易行，無設備要求，無感染及創傷的副作用，尤其對依賴性差的病人更為適用。隨著免疫學及分子生物學技術的不斷發展，細胞增殖學說越來越受到重視，國內外大量研究表明，外陰硬化性苔癬組織的細胞增殖活躍可能與多種細胞周期調控因子表達異常相關。研究表明，cyclin D1及p16是細胞周期內源性調控的核心因子，且cyclin D1蛋白的表達水平升高與外陰白色病變密切相關，p16蛋白是參與調控外陰白色病變的另一重要因子，兩者共同調控著細胞的分裂增殖及凋亡。目前研究證實，cyclin D1推動細胞從G1期向S期轉化，啟動細胞分裂增殖周期的進程，cyclin D1蛋白的過度表達以及p16的不表達或表達水平低下都可使細胞增殖失常。本研究證實，觀察組經復方麝香膏治療后病變組織cyclin D1表達降低、p16表達升高，我們推斷復方麝香膏治療外陰硬化性苔癬可能通過調控cyclin D1及p16基因的表達，進而調節細胞周期依賴激酶的活性，使細胞的分裂增殖、凋亡恢復正常，從而使病變組織恢復正常。

綜上，復方麝香膏能使外陰硬化性苔癬病變組織中cyclin D1蛋白水平下降，并同時升高p16蛋白水平，近期臨床療效確切。