α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、上皮鈣黏素在腹膜透析大鼠腹膜組織中的表達(dá)及意義

終末期腎臟病（End-stage renal disease，ESRD）是各種慢性腎臟疾病的終末階段，可引起尿毒癥的各種癥狀，臨床只能采用腎臟替代療法治療。腹膜透析是目前ESRD病人常用的替代治療方法之一，具有良好的治療效果。隨著腹膜透析的長(zhǎng)期進(jìn)行，腹膜透析病人易并發(fā)腹膜纖維化（Peritoneal fibrosis，PF），引起腹膜結(jié)構(gòu)和功能的改變，出現(xiàn)超濾衰竭，導(dǎo)致腹膜透析治療失敗。分析腹膜透析病人發(fā)生PF的機(jī)制，尋找特異性的分子標(biāo)志物，對(duì)于臨床治療具有重要意義。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（asmooth muscle actin，α-SMA）是成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，參與肺臟、肝臟、腎臟等多組織的纖維化。上皮鈣黏素（E-cadherin）是一類(lèi)鈣依賴(lài)性跨膜糖蛋白，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞間的粘附具有重要作用。已有研究顯示，α-SMA和E-cadherin在腹膜纖維化大鼠中出現(xiàn)差異表達(dá)，但其在腹膜透析大鼠中的表達(dá)及其與腹膜組織病變之間的關(guān)系尚不清楚。因此，本課題組于2018年10月至2019年3月建立了腹膜透析大鼠模型，探討α-SMA和E-cadherin在腹膜透析大鼠中的表達(dá)及意義，旨在為臨床ESRD的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與動(dòng)物

光學(xué)顯微鏡（BX50）購(gòu)自日本Olympus公司；4.25%腹膜透析液購(gòu)自上海長(zhǎng)征富民金山制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020945；SP免疫組化試劑盒購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；RT-PCR試劑盒、引物均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；小鼠抗α-SMA抗體和E-cadherin抗體、生物素標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。

SPF級(jí)SD大鼠雄性45只，周齡范圍為12～15周，體質(zhì)量范圍為180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2017-0001，飼養(yǎng)于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，保持室溫恒定為25℃，模擬晝夜，自由攝食與飲水。

1.2 動(dòng)物造模及給藥

抽簽選取26只大鼠預(yù)飼養(yǎng)7 d后，采用5/6腎切除法制備大鼠尿毒癥模型，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，常規(guī)消毒皮膚，取側(cè)臥位，逐層切開(kāi)皮膚以及肌肉，游離腎臟，剝除腎包膜，切除左腎的上下極約全腎的2/3，電凝刀電凝止血，術(shù)后一周行右側(cè)切口，進(jìn)行右腎全切，術(shù)后第5周，采集大鼠尾靜脈血液，采用生化分析儀測(cè)定腎功能，若腎功能異常則造模成功。26只大鼠死亡5只，21只造模成功，抽簽選取造模成功的20只大鼠將其分為模型組和腹膜透析組。剩余的19只大鼠抽簽選取10只大鼠為假手術(shù)組，僅切開(kāi)皮膚，游離腎臟，剝除左、右腎包膜，不進(jìn)行切除。術(shù)后第5周行腹透植管術(shù)，在下腹中線右側(cè)0.2 cm處植入自制腹透管，植管2周以后假手術(shù)組和模型組每日腹腔灌注生理鹽水20 mL，腹膜透析組每日腹腔灌注4.25%腹膜透析液20 mL，共持續(xù)6周。

1.3 腹膜平衡試驗(yàn)

大鼠停止透析24 h后行腹膜平衡試驗(yàn)，通過(guò)腹透導(dǎo)管腹腔灌注20 mL 4.25%腹膜透析液，90 min后處死大鼠，采用注射器收集大鼠腹腔內(nèi)液體，計(jì)算腹膜超濾量，并測(cè)定透出液肌酐（D-Scr）、血肌酐（P-Scr）、初始腹透液葡萄糖（D0）及透出液中葡萄糖（D1）的濃度，計(jì)算D/P-Scr和D1/D0值。

1.4 腹膜組織病理學(xué)檢查

無(wú)菌條件下，取大鼠腹部壁層腹膜組織，用4%多聚甲醛溶液固定24 h后，進(jìn)行常規(guī)的脫水、透明、浸蠟及包埋，切片（約4μm厚），一份進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察腹膜組織的病理學(xué)變化；一份切片采用Masson染色，測(cè)量腹膜厚度，每張切片盲法隨機(jī)測(cè)量12個(gè)高倍鏡視野，平均值作為腹膜組織厚度。

1.5 RT

-

PCR測(cè)定腹膜組織α

-

SMA和E

-

cadherin mRNA的表達(dá)

取大鼠腹部壁層腹膜組織約50 mg，勻漿，用Trizol法提取組織的總mRNA，采用紫外分光光度計(jì)確定其濃度，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA（cDNA），進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，α-SMA正向引物：5"-TTACGAGTTGCCTGATGG-3"，反向引物：5"-TGCTGTTGTAGGTGGTTTC-3"，E-cadherin正向引物：5"-AGTGAACAACGATGGCATTT-3"，反向引物：5"-CTCAGCCCGAGTGGAAAT-3"，反應(yīng)體系參考已有文獻(xiàn)報(bào)道。

1.6 免疫組化檢測(cè)腹膜組織種

α-

SMA和E

-

cadherin蛋白的表達(dá)

另一份切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，將切片置于65℃烤箱脫蠟水化2 h，依次經(jīng)二甲苯透明，梯度乙醇脫水，加入EDTA（乙二胺四乙酸）緩沖液修復(fù)抗原10 min，加入3%過(guò)氧化氫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加入BSA（牛血清白蛋白）封閉20 min，加入50μL一抗（1∶200），4℃下孵育過(guò)夜，加入50μL生物素標(biāo)記的二抗（1∶500）孵育1 h，加入DAB（二氨基聯(lián)苯胺）顯色，蘇木素復(fù)染，氨水返藍(lán)，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)定其平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 腹膜組織的超濾量和轉(zhuǎn)運(yùn)能力

與假手術(shù)組相比，模型組和腹膜透析組大鼠的腹膜超濾量和D1/D0明顯下降（

P

＜0.05），D/P-Scr明顯升高（

P

＜0.05）；模型組相比，腹膜透析組大鼠的腹膜超濾量和D1/D0明顯下降（

P

＜0.05），D/P-Scr明顯升高（

P

＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腹膜組織的超濾量和轉(zhuǎn)運(yùn)能力/±s

2.2 腹膜組織的病理組織學(xué)變化

HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠腹膜組織有一層連續(xù)的扁平間皮細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞排列完整有序；模型組大鼠腹膜組織有部分間皮細(xì)胞層脫落，炎癥細(xì)胞增多；腹膜透析組大鼠腹膜表面有部分甚至全部間皮細(xì)胞層脫落，炎癥細(xì)胞明顯增多；Masson染色顯示，假手術(shù)組大鼠腹膜組織薄且完整；模型組大鼠腹膜組織厚度增加；腹膜透析組大鼠腹膜厚度增加，基質(zhì)增厚明顯，可見(jiàn)纖維細(xì)胞增生，見(jiàn)圖1。與假手術(shù)組（12.14±1.53）μm相比，模型組（20.51±2.72）μm和腹膜透析組（36.74±4.83）μm大鼠的腹膜厚度明顯增加（

P

＜0.05）；模型組相比，腹膜透析組大鼠的腹膜厚度明顯增加（

P

＜0.05），

F

=141.923，

P

＜0.001。

2.3 腹膜組織中α

-

SMA和E

-

cadherin的mRNA水平

與假手術(shù)組相比，模型組和腹膜透析組大鼠α-SMA的mRNA水平明顯上調(diào)（

P

＜0.05），E-cadherin的mRNA水平明顯下調(diào)（

P

＜0.05）；模型組相比，腹膜透析組大鼠α-SMA的mRNA水平明顯上調(diào)，E-cadherin的mRNA水平明顯下調(diào)（

P

＜0.05），各組大鼠α-SMA和E-cadherin的mRNA水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（

P

＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腹膜組織中α-SMA和E-cadherin的mRNA水平比較/±s

2.4 腹膜組織中α

-

SMA和E

-

cadherin蛋白的表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組和腹膜透析組大鼠α-SMA的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，E-cadherin的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）；模型組相比，腹膜透析組大鼠α-SMA的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，E-cadherin的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），各組大鼠α-SMA和E-cadherin的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），見(jiàn)圖2、表3。

表3 各組大鼠腹膜組織中α-SMA和E-cadherin蛋白的表達(dá)比較/±s

2.5α

-

SMA和E

-

cadherin的mRNA水平與腹膜結(jié)構(gòu)和功能之間的相關(guān)性

大鼠腹膜組織中α-SMA的mRNA水平與腹膜厚度和D/P-Scr呈正相關(guān)關(guān)系（

P

＜0.05），與腹膜超濾量和D1/D0呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（

P

＜0.05）；E-cadherin的mRNA水平與腹膜厚度和D/PScr呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（

P

＜0.05），與腹膜超濾量和D1/D0呈正相關(guān)關(guān)系（

P

＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 α-SMA和E-cadherin的mRNA水平與腹膜結(jié)構(gòu)和功能之間的Pearson相關(guān)性分析

3 討論

腹膜透析是ESRD病人最主要的治療手段之一，利用腹膜作為半滲透膜，通過(guò)注入腹腔的腹膜透析液與腹膜血管中的血液進(jìn)行水分和溶質(zhì)的交換，清除機(jī)體的代謝產(chǎn)物和毒性物質(zhì)，糾正電解質(zhì)和酸堿平衡。臨床研究顯示，隨著腹膜透析時(shí)間的延長(zhǎng)，長(zhǎng)期腹膜透析病人可出現(xiàn)腹膜結(jié)構(gòu)和功能的改變，出現(xiàn)PF，導(dǎo)致臨床治療失敗。分析腹膜透析病人并發(fā)PF的機(jī)制，對(duì)于臨床治療具有重要意義。因此，本研究建立了大鼠尿毒癥模型和腹膜透析模型，模擬臨床腹膜透析ESRD病人，來(lái)分析腹膜透析病人并發(fā)PF的機(jī)制。本研究中，模型組大鼠的腹膜超濾量、D1/D0明顯下降，D/P-Scr明顯升高，可能是由于尿毒癥大鼠體內(nèi)代謝廢物、毒性物質(zhì)的蓄積，引起水、電解質(zhì)平衡紊亂，在一定程度上影響了腹膜的功能。本研究中，相比于模型組大鼠，腹膜透析大鼠的腹膜超濾量、D1/D0明顯下降，D/P-Scr明顯升高。腹膜超濾量是透出身體內(nèi)毒素及小分子，D1/D0和D/P-Scr主要反映了腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)小分子溶質(zhì)的能力，提示腹膜透析大鼠腹膜組織清除小分子的能力下降。吳煒飛等的研究顯示，腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力是評(píng)價(jià)ESRD病人腹膜透析治療后死亡率的關(guān)鍵因子，腹膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的改變，引起小分子溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的增加，腹膜超濾量的減少，最終引起超濾衰竭，迫使ESRD病人退出腹膜透析治療，提示腹膜透析大鼠在長(zhǎng)期接受腹膜透析治療的過(guò)程中，可能發(fā)生了腹膜組織結(jié)構(gòu)和功能的改變，引起腹膜超濾量下降，轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降。

腹膜主要由腹膜間皮細(xì)胞層和間皮下的間皮組織構(gòu)成，腹膜間皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性是保證腹膜功能的重要因素。本研究中，腹膜透析大鼠的腹膜厚度增加，可見(jiàn)纖維細(xì)胞增生，提示腹膜透析大鼠發(fā)生了PF，引起了腹膜間皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變。本研究中，腹膜透析大鼠的α-SMA的表達(dá)明顯上調(diào)，E-cadherin的表達(dá)明顯下調(diào)。α-SMA是成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，活化的成纖維細(xì)胞可以分泌大量的α-SMA，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和沉積，可以促進(jìn)PF的發(fā)生。E-cadherin是一種鈣依賴(lài)性的跨膜糖蛋白，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)和調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附具有重要作用。臨床研究顯示，E-Cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，可以導(dǎo)致細(xì)胞間黏附作用下降，出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞的表型，促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌大量的α-SMA，最終導(dǎo)致PF發(fā)生，提示腹膜透析大鼠的腹膜間皮細(xì)胞在長(zhǎng)期接受腹膜透析的過(guò)程中，E-Cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，發(fā)生了表型轉(zhuǎn)變，呈現(xiàn)為肌成纖維細(xì)胞，使得α-SMA表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)PF的發(fā)生。本研究中，α-SMA和E-Cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示E-Cadherin表達(dá)下調(diào)可能通過(guò)促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞向肌成纖維的表型轉(zhuǎn)變，促進(jìn)α-SMA的分泌增加。本研究中，α-SMA和E-Cadherin的表達(dá)與腹膜厚度、腹膜超慮量、D1/D0和D/P-Scr具有相關(guān)性，提示α-SMA和E-Cadherin的表達(dá)與腹膜的功能密切相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)α-SMA和E-Cadherin參與了PF的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，腹膜透析大鼠的α-SMA的表達(dá)明顯上調(diào)，E-Cadherin的表達(dá)明顯下調(diào)，α-SMA和E-Cadherin的表達(dá)與腹膜厚度、腹膜超慮量、D1/D0和D/PScr具有相關(guān)性，有望應(yīng)用于臨床腹膜透析病人的治療。但腹膜透析病人腹膜組織中α-SMA和E-Cadherin的表達(dá)是否與腹膜透析大鼠一致尚不清楚，有待于進(jìn)一步的臨床研究。