血清微小RNA-34a、沉默信息調節因子2相關酶1水平與老年腦梗死病人頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性的關系研究

腦梗死又稱缺血性卒中，是一種嚴重威脅人類健康的腦血管疾病。目前認為頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis，CAS）是腦梗死發生的病理基礎，其中CAS不穩定斑塊的形成在腦梗死發病中起關鍵作用。研究發現內皮損傷、脂質代謝異常及氧化應激等與CAS發生、發展密切相關。微小RNA-34a（microRNA-34a，miR-34a）屬于miR-34家族，其異常表達與內皮損傷及其功能紊亂有關，在心血管疾病發展進程中具有重要作用。而沉默信息調節因子2相關酶1（sir2-related enzyme 1，Sirt1）是miR-34a作用的靶基因之一，可通過改善血管內皮功能、調節脂質代謝及抗氧化應激等多種機制抑制CAS發生及斑塊形成、發展。近年來，miR-34a、Sirt1與腦血管內皮損傷的關系已成為神經科研究熱點，但兩者與腦梗死病人CAS斑塊穩定性關系的研究報道較少。鑒于此，本研究通過檢測血清miR-34a、Sirt1水平，分析兩者與老年腦梗死病人CAS斑塊穩定性的關系，以期為臨床治療老年腦梗死提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2019年6月邯鄲明仁醫院收治的老年腦梗死病人170例作為腦梗死組。納入標準：①均符合腦梗死相關診斷標準；②均為首次發病，且發病至入院時間＜72 h；③年齡≥60周歲；④臨床資料詳細完整。排除標準：①合并心肌梗死、冠心病等心血管疾病者；②伴有其他腦部器質性病變者；③近3個月內服用過降脂藥物者；④具有精神疾病者。腦梗死組男98例，女72例；年齡（69.23±9.10）周歲，范圍為60～88周歲；體質量指數（BMI）（25.48±4.50）kg/m，范圍為18～30 kg/m。另選取該院同期體檢健康者150例作為對照組，其中男86例，女64例；年齡（69.03±8.97）周歲，范圍為60～88周歲；BMI（24.67±3.95）kg/m，范圍為18～29 kg/m。兩組組一般資料相比，均差異無統計學意義（

P

＞0.05）。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，且病人均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1

頸動脈超聲檢查 受試者均接受頸動脈超聲檢查，由本院一名經驗豐富超聲科醫師單獨操作，使用西門子ACUSON S2000彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為4.5～8.5 MHz。取仰臥位，從頸部動脈橫、縱兩個切面掃查頸總動脈及其分叉處、頸內及頸外動脈，觀察頸動脈內-中膜厚度（intima-media thickness，IMT）、管腔內有無斑塊及斑塊部位、形態及回聲特點等。CAS斑塊形成診斷標準：①IMT＜1.0 mm為頸動脈正常，②1.0 mm≤IMT≤1.2 mm為內膜增厚，③IMT＞1.2 mm為CAS斑塊形成；將①、②作為無斑塊組（

n

=43），③作為斑塊組（

n

=127）。斑塊組又可根據CAS斑塊特征分為：①均質、強回聲的硬斑塊，②均質、等回聲的扁平斑塊，③均質、低回聲的軟斑塊，④不均質回聲的混合斑塊；其中硬斑塊與扁平斑塊屬于穩定斑塊組（

n

=59），軟斑塊與混合斑塊屬于不穩定斑塊組（

n

=68）。

1.2.2

血清miR-34a、Sirt1水平檢測 分別抽取腦梗死組病人入院第2天清晨、對照組體檢當天空腹時靜脈血，各6 mL，在3 000 r/min離心機中離心15 min，提取血清置于-80℃超低溫冰箱中保存。取1.5 mL，使用實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）檢測血清miR-34a水平。血清總RNA提取嚴格按照沈陽萬類生物科技有限公司提供的Trizol試劑盒說明書進行，并根據北京麥瑞博生物科技有限公司提供的PrimeScriptRT reagent Kit試劑盒中方法合成cDNA鏈。以U6作為對照進行qRT-PCR反應，引物序列均由上海昕浩生物科技有限公司合成，miR-34a引物為：正向5"-TCTGTCTCTCTTGGCAGTGTCTT-3"，反向5"-AATGGTTGTTCTCCACTCTCTCTC-3"；U6引物為：正向5"-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3"，反 向5"-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3"。反應條件為95℃、5 min，95℃、30 s，60℃、30 s，40個循環。重復3次，并用2法計算血清miR-34a相對表達量。另取血清1.5 mL，使用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測Sirt1水平，試驗步驟嚴格按照人Sirt1試劑盒（購自上海滬震實業有限公司）說明書進行。剩余血清3 mL用于檢測血脂相關指標。

1.2.3

血脂檢測 采用AU5800全自動生化分析儀（由貝克曼庫爾特商貿有限公司提供）檢測三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

2 結果

2.1 對照組與腦梗死組血清miR

-

34a、Sirt1水平比較

腦梗死組病人血清miR-34a水平明顯高于對照組（

P

＜0.05），血清Sirt1水平明顯低于對照組（

P

＜0.05）。見表1。

表1 對照組與腦梗死組血清miR-34a、沉默信息調節因子2相關酶1（Sirt1）水平比較/±s

2.2 腦梗死組病人不同CAS斑塊性質臨床資料比較

腦梗死組病人不同CAS斑塊性質年齡、總膽固醇、LDL-C比較，均差異有統計學意義（

P

＜0.05）；三酰甘油、HDL-C相比，均差異無統計學意義（

P

＞0.05）。不穩定斑塊組病人年齡明顯大于無斑塊組病人（

P

＜0.05）；不穩定斑塊組、穩定斑塊組病人總膽固醇、LDL-C明顯高于無斑塊組病人（

P

＜0.05），不穩定斑塊組病人總膽固醇、LDL-C明顯高于穩定斑塊組病人（

P

＜0.05）。見表2。

表2 腦梗死組病人不同頸動脈粥樣硬化（CAS）斑塊性質臨床資料比較/±s

2.3 腦梗死組病人不同CAS斑塊性質血清miR

-

34a、Sirt1水平比較

腦梗死組病人不同CAS斑塊性質血清miR-34a、Sirt1水平比較，均差異有統計學意義（

P

＜0.05）。不穩定斑塊組、穩定斑塊組病人血清miR-34a水平均明顯高于無斑塊組（

P

＜0.05），血清Sirt1水平均明顯低于無斑塊組（

P

＜0.05）；不穩定斑塊組病人血清miR-34a水平明顯高于穩定斑塊組病人（

P

＜0.05），血清Sirt1水平明顯低于穩定斑塊組病人（

P

＜0.05）。見表3。

表3 腦梗死組病人不同頸動脈粥樣硬化（CAS）斑塊性質血清miR-34a、沉默信息調節因子2相關酶1（Sirt1）水平比較/±s

2.4 影響老年腦梗死病人CAS不穩定斑塊形成的危險因素logistic回歸分析

將老年腦梗死病人是否具有CAS不穩定斑塊作為因變量［無CAS不穩定斑塊（無斑塊組＋穩定斑塊組）=0，有CAS不穩定斑塊=1］，將年齡、總膽固醇、LDL-C、miR-34a、Sirt1作為自變量進行logistic回歸分析，結果顯示年齡、miR-34a均為老年腦梗死病人CAS不穩定斑塊形成的獨立危險因素（

P

＜0.05），Sirt1為保護性因素（

P

＜0.05）。見表4。

表4 影響老年腦梗死病人頸動脈粥樣硬化（CAS）不穩定斑塊形成的危險因素logistic回歸分析

3 討論

腦梗死是臨床致殘率、復發率均較高的重要疾病之一，其發生與CAS斑塊破裂導致的血栓形成有關。CAS斑塊由泡沫細胞、遷移的平滑肌細胞等多種細胞組成，上述細胞可通過與血管內皮細胞間相互作用破壞血管壁的穩態，導致斑塊內出血或斑塊破裂等，最終引起血栓事件。因此，探討與老年腦梗死病人CAS斑塊穩定性相關的血清標志物顯得尤為重要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類不編碼蛋白質的小RNA，在心血管功能調控中具有重要作用，已逐漸成為心腦血管疾病的潛在生物標志物。miR-34a是目前研究比較有前景的miRNA，主要表達于心、腦組織中，在血管新生及心腦血管疾病發生中扮演著重要角色。研究發現血管內皮細胞功能失調與CAS發展進程有關，而miR-34a可通過調節血管內皮功能，參與CAS發生與斑塊形成。范智文等研究報道，當歸補血湯可通過抑制miR-34a、上調Sirt1表達在抗心肌梗死后心室重塑上發揮作用。還有研究發現，miR-34a介導的內皮細胞衰老與其靶基因Sirt1有關。Sirt1是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的第三類組蛋白去乙?；?，基因定位于染色體10q22.1，由8個內含子和9個外顯子組成。Hu等研究報道，Sirt1可通過上調內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）水平，促進血管內皮源性血管舒張因子產生，從而起到保護血管內皮作用。鄢曉麗等研究發現，慢性心力衰竭病人血清Sirt1水平明顯低于對照組，且其水平變化與心功能分級有關，心功能分級越差，血清Sirt1水平越低。綜上發現，探討血清miR-34a、Sirt1水平與老年腦梗死病人CAS斑塊穩定性的關系，具有一定臨床意義。

本研究中，腦梗死組病人血清miR-34a水平遠高于對照組，血清Sirt1水平遠低于對照組，提示血清miR-34a水平升高、Sirt1水平降低可能與老年腦梗死發病有關。進一步研究發現，不穩定斑塊組病人年齡遠大于無斑塊組，且總膽固醇、LDL-C高低依次為不穩定斑塊組、穩定斑塊組、無斑塊組，提示年齡、總膽固醇、LDL-C可能與老年腦梗死病人CAS斑塊形成有關。本研究還發現，腦梗死組病人不同CAS斑塊性質血清miR-34a水平高低依次為：不穩定斑塊組、穩定斑塊組、無斑塊組，血清Sirt1水平高低依次為：無斑塊組、穩定斑塊組、不穩定斑塊組，提示血清miR-34a水平升高、Sirt1水平降低可能在CAS斑塊形成、發展中起重要作用。此外，多因素logistic回歸分析顯示，年齡、miR-34a為老年腦梗死病人CAS不穩定斑塊形成的獨立危險因素，Sirt1為保護性因素，提示除年齡外，miR-34a、Sirt1可能是潛在用于預測老年腦梗死病人CAS不穩定斑塊形成的血清標志物。

綜上所述，老年腦梗死病人血清miR-34a水平升高、Sirt1水平降低，兩者水平變化與CAS斑塊形成有關，且是老年腦梗死病人CAS不穩定斑塊形成的獨立影響因素，可能為防治CAS斑塊提供幫助。