微小RNA-125a-3p介導Notch1信號通路對骨質疏松性骨折大鼠愈合過程的影響

骨質疏松癥是一種常見的骨骼疾病，病人骨骼脆弱，有更高的骨折風險。骨質疏松癥給世界許多國家或地區的醫療保健系統造成了沉重且日益增加的負擔。骨質疏松性骨折病人的生活質量降低、病死率升高，并且需占用大量的醫療資源。同時，骨質疏松會降低骨折愈合過程中骨痂的生物力學特性，因此，骨質疏松性骨折愈合過程的生物力學特征和正常骨折不盡相同。。引起繼發性骨質疏松的原因有許多，其中主要因素還是年齡增長。骨質疏松大大影響了老年人的日常生活活動，骨質疏松和骨質疏松性骨折的預防及治療仍是當前的一大難題。近年來，盡管包括抗再吸收藥物及合成代謝藥物在內的幾種藥物已取得不錯進展，但是骨質疏松性骨折的臨床療效仍然有待提高。開發新的治療方法以及加快正常的骨修復過程仍是目前骨折治療的主要挑戰。

microRNA（miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的小型單鏈非編碼RNA，它們在真核生物中廣泛表達。miRNA在調節基因表達方面發揮著重要作用，可參與多種代謝疾病的調控，包括骨質疏松。同時，在骨代謝中，miRNA與骨形成、吸收、重塑和成骨細胞分化等密切相關。越來越多的文獻指出miRNA可作為調控骨折修復的關鍵分子。例如，有研究發現，miR-140-3p、miR-140-5p、miR-181a-5p、miR-181d-5p和miR-451a在骨折修復中發揮重要作用。同時，有研究發現下調miR-367表達可以促進成骨細胞生長及增殖，進而促進骨折修復。但是miR-125a-3p在骨質疏松性骨折修復方面的作用尚未明確。經生物信息學網站（http：//www.targetscan.org）預測，miR-125a-3p可與Notch1靶向結合。Notch通路對組織重生，骨骼發育與骨重塑至關重要，其異常表達可能會導致一系列的骨骼疾病。綜上所述，本研究于2018年9月至2019年6月通過大鼠實驗，就miR-125a-3p在骨質疏松性骨折中的作用展開了研究。

1 材料與方法

1.1 骨質疏松骨折大鼠模型的建立

1.1.1

大鼠的飼養 6月齡Wistar雌性大鼠58只，體質量范圍為250～300 g，購于湖南斯萊克景達動物公司［動物許可證號：SCXK（湘）2018-004］。置于恒溫恒濕環境中，明12 h，暗12 h。標準固體飼料，飲用無菌水。所有老鼠按照隨機數字表法分組，假手術組8只，實驗模型組50只。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2

骨質疏松大鼠模型的建立 所有老鼠手術前禁飲食6 h，在用10%水合氯醛按3 mL/kg進行腹腔麻醉。無菌條件下，實驗模型組經背部進入切除雙側卵巢后立即縫合傷口；假手術組前期步驟相同，但不切除卵巢，僅切除卵巢附近同等重量脂肪。自由飲食，正常飼養3個月，實驗組中按照隨機數字表法選取8只與假手術組8只在再次麻醉作用后進行骨密度測定，驗證骨質疏松模型是否成立。

1.1.3

骨質疏松骨折大鼠模型的建立 選取骨質疏松模型成立大鼠40只，再次禁食6 h，同上述條件麻醉大鼠，隨機選取大鼠一側股骨，去毛干凈，0.5%碘伏消毒。股骨中點外側縱行切口，小鋼鋸鋸斷股骨，克氏針髓內固定，依次縫合傷口。

1.2 大鼠體內mRNA轉染

模型組老鼠按照隨機數字表法分為5組（

n

=8）：模型組、inhibitor NC組（轉染抑制劑陰性對照組）、miR-125a-3p inhibitor組（轉染miR-125a-3p抑制劑）、si-Notch1組（轉染Notch si-RNA干擾）、miR-125a-3p inhibitor+si-Notch1組（miR-125a-3p抑制劑及Notch1 si-RNA聯用組）。miR-125a-3p inhibitor、inhibitor NC、si-Notch1核酸序列均有廣州銳博生物科技有限公司設計并合成，動物體內轉染采用英格恩動物體內轉染試劑（Entranster-in vivo，186658-11，北京）。骨折手術1個星期后，每只老鼠皮下注射100μL核酸溶液（均5μg核酸溶于100μL轉染試劑），每周1次，連續4周。轉染完成8周后繼續后續實驗操作。

1.3 雙熒光素酶報告實驗

利用生物信息學網站http：//www.targetscan.org預測miR-125a-3p與Notch1的結合位點后，再用雙熒光素酶報告實驗檢測miR-125a-3p對Notch1的靶向調節作用。將Notch1基因3"非翻譯區（UTR）端野生型（WT）及突變型（Mut）質粒克隆到雙熒光報告質粒中（Promega，美國），然后分別與miR-125a-3p mimic及miR-NC（合成并購于廣州銳博生物科技有限公司）共轉染至H293T細胞（購于中科院上海細胞庫）中，海腎熒光素酶作為內參，轉染48 h后收集細胞并用雙熒光素酶報告實驗檢測試劑盒dual-luciferase reporter assay system（Promega，美國）檢測熒光活性，以螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性作為相對值進行統計分析。

1.4 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT

-

PCR）檢測相關基因表達

取各組大鼠股骨斷端組織標本100 mg，加入1mL Trizol（Invitrogen，美國，貨號15596026），組織勻漿后按說明書操作提取總RNA。紫外分光光度計測定其濃度及純度，備用。取2μg的RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit（RR047A，Takara，Japan）說明書操作，將mRNA逆轉成互補DNA（cDNA）。本實驗所有引物由上海生工設計并合成（表1），miR-125a-3p以U6為內參，Notch1以GAPDH為內參，進行qRT-PCR實驗，反應設定條件為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，57℃退火20 s，72℃延伸30 s，45個循環。2表示實驗組與對照組目的基因表達的倍比關系，計算細胞中各基因的表達量。

表1 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）引物序列表

1.5 病理組織及免疫組化分析

轉染8周后，測完骨密度測定后，每組取4只大鼠，斷頸處死。去除股骨肌肉組織，拔掉克氏針，取骨折斷端組織，鹽水沖洗后常規固定、脫鈣、脫水、包埋切片，用于蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組化分析。

病理組織學觀察：石蠟包埋切片（5μm），二甲苯脫蠟，后用蘇木素和伊紅染色，不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，封片，在顯微鏡下觀察骨組織的病理變化。

免疫組化分析：首先，脫蠟、水化組織切片，進行抗原修復。接著3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶活性，10%山羊血清封閉10 min，滴加BMP-2一抗（ab6285，Abcam，英國），4℃孵育24 h。PBS洗滌后滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，于顯微鏡下觀察，棕褐色的骨細胞為BMP-2表達陽性細胞。每組選取15張切片，每張隨機選一個視野，采用Image-Pro Plus分析系統測量陽性細胞吸光度值。

1.6 骨密度檢測

轉染2、4、6、8周后的每組8只老鼠按照隨機數字表法取4只，采用美國GE公司Lunar prodigy雙能X線骨密度儀，采用小動物掃描模式，掃描術側股骨，測定骨痂骨密度。

1.7 生物力學測定

每組選剩余4只大鼠術側股骨，去除肌肉等軟組織、拔掉克氏針，進行三點彎曲實驗測量股骨力學強度。

2 結果

2.1 骨質疏松性骨折大鼠模型中miR

-

125a

-

3p表達上調，Notch1表達下調

大鼠股骨骨密度測定檢測判斷骨質疏松模型是否成立，結果發現模型組較假手術組骨密度明顯下降（

P

＜0.05），說明模型建立成功。qRT-PCR檢測假手術組及模型組中miR-125a-3p及Notch1表達情況。結果顯示，與假手術組相比，模型組中miR-125a-3p表達量均顯著上調，Notch1表達下調（均

P

＜0.05）。見表2。

表2 miR-125a-3p及Notch1基因在骨質疏松性骨折大鼠中的表達/±s

2.2 miR

-

125a

-

3p與Notch1具有靶向結合關系

Target Scan網站顯示miR-125a-3p和Notch1具有靶向結合關系。在此基礎上進行雙熒光素酶報告檢測發現，與miR-NC組相比，miR-125a-3p mimic與突變型Notch1-Mut共轉染組的熒光素酶活性強度無明顯改變（

P

＞0.05），與野生型Notch1-WT共轉染組中熒光素酶活性強度明顯下降（

P

＜0.05）。以上結果說明miR-125a-3p可以靶向調控Notch1基因的表達。見表3、圖1。

表3 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-125a-3p與Notch1之間的靶向關系/±s

2.3 干擾miR

-

125a

-

3p及Notch1表達后其在骨質疏松性骨折大鼠中的表達情況

為了進一步研究miR-125a-3p對Notch1的調控，qRT-PCR檢測轉染后各組中miR-125a-3p的表達情況，結果顯示，模型組與inhibitor NC組、si-Notch1之間差異無統計學意義（

P

＞0.05）；與inhibitor NC組相比，miR-125a-3p inhibitor組及miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1組表達明顯下調（

P

＜0.05）。qRT-PCR檢測轉染后各組中Notch1的表達情況，結果顯示，與模型組與inhibitor NC組之間差異無統計學意義（

P

＞0.05）；與inhibitor NC組相比，miR-125a-3p inhibitor組Notch1表達顯著提高，si-Notch1組表達顯著降低（

P

＜0.05）。與si-Notch1組相比，miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1組Notch1表達顯著提高（

P

＜0.05）。見表4。

上述結果說明miR-125a-3p抑制及Notc1干擾轉染效率良好，且進一步驗證了miR-125a-3p可靶向負調控Notch1的表達。

表4 miR-125a-3p及Notch1在基因水平的表達情況/±s

2.4抑制miR

-

125a

-

3p或干擾Notch1表達后HE染色分析

轉染8周后，組織學觀察顯示，假手術組骨小梁開始大量形成，厚度均勻，排列緊密、方向一致。模型組、inhibitor NC組骨細胞數大量減少，骨小梁較細，間隙較大且排列紊亂。miR-125a-3p inhibitor組骨小梁厚度明顯增加，骨細胞數增多，骨質改善，與假手術組顯微形態較為相似。si-Notch組骨細胞數大量缺失，骨小梁間隙極大，顯微結構較模型組病理形態更為明顯。miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1組介于miR-125a-3p inhibitor組與si-Notch1組之間，骨小梁厚度有所增加，但相比假手術組仍顯稀薄。見圖2。

2.5 抑制miR

-

125a

-

3p或干擾Notch1表達后免疫組化檢測各組骨組織BMP

-

2的表達

轉染8周后取骨折斷端組織，免疫組化檢測骨形態發生蛋白BMP-2表達。結果顯示，BMP-2主要沉淀在骨小梁周圍及成骨細胞的細胞質內。假手術組陽性細胞表達明顯高于模型組，模型組與inhibitor NC組之間差異無統計學意義（

P

＞0.05）。同inhibitor NC組相比，miR-125a-3p inhibitor組陽性表達明顯增加，si-Notch1組顯著減少（

P

＜0.05）。同miR-125a-3p inhibitor組相比，miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1組陽性細胞表達顯著降低，與si-Notch1組相比則明顯增多（均

P

＜0.05），

F

=68.573，

P

=0.002。見圖3。

2.6 抑制miR

-

125a

-

3p或干擾Notch1表達后骨密度及生物力分析

表5顯示轉染結束2、4、6、8周后，分別進行骨密度測量，結果顯示，除假手術組以外，其它組隨著時間的延長骨密度呈梯度增長；第4、6、8周，同假手術組相比，模型組骨密度明顯下降（

P

＜0.05）；模型組與inhibitor NC組之間差異無統計學意義（

P

＞0.05）。同inhibitor NC組相比，miR-125a-3p inhibitor組骨密度顯著上升，si-Notch1組顯著降低（

P

＜0.05）。同miR-125a-3p inhibitor組相比，miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1組各項骨生物力學指標顯著下降（

P

＜0.05）。表6 測術側股骨三點彎曲載荷顯示，同假手術組相比，模型組各項骨生物力學指標，包括最大負載、極限應力及剪切應力均明顯下降（

P

＜0.05）；模型組與inhibitor NC組之間差異無統計學意義（

P

＞0.05）。同inhibitor NC組相比，miR-125a-3p inhibitor組各項骨生物力學指標顯著上升，si-Notch1組顯著降低（

P

＜0.05）。同miR-125a-3p inhibitor組相比，miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1組各項骨生物力學指標顯著下降；與si-Notch1組相比，則顯著上升（均

P

＜0.05）。提示抑制miR-125a-3p的表達可以改善骨質疏松骨折大鼠的生物力學狀態。

表5 不同時間骨痂骨密度/（mg/cm2，±s）

表6 轉染8周后SD大鼠股骨生物力學指標/±s

3 討論

近年來，骨質疏松病人的骨折發病率持續升高，同時由于病人骨骼質量相對較差，更是給外科手術治療帶來嚴峻挑戰。所幸，基于miRNA的靶向基因的療法在治療骨科疾病上顯示出了巨大的潛力，包括骨質疏松癥及骨質疏松性骨折。本研究就miR-125a-3p表達對骨質疏松性骨折的恢復展開研究，發現抑制miR-125a-3p可以促進Notch1表達，增強骨密度及骨生物力學強度，增強BMP-2陽性表達，進而促進骨質疏松性大鼠骨折愈合。

近年來，miRNA和骨骼發展的關系引起了廣泛關注。例如，miR-141經研究可以抑制破骨細胞生成以及骨的再吸收，從而為骨質疏松治療提供新的治療方案。也有文獻表明，miR-137的異常表達會增加骨質疏松性骨折的發病概率。本研究研究中，筆者通過大鼠模型發現，miR-125a-3p在骨質疏松性骨折大鼠中表達較高，而Notch-1表達較低。經生物信息學網站TargetScan分析及雙熒光素酶報告基因實驗發現，miR-125a-3p可與Notch1的3" UTR區靶向結合，進而抑制Notch1表達和通路激活。隨后，聯合實驗發現，抑制miR-125a-3p表達后，骨質疏松性骨折大鼠骨小梁厚度明顯增加，骨細胞數增多，骨質得到改善，而抑制Notch1表達后，大鼠骨細胞數缺失嚴重。骨小梁缺失是骨質疏松性骨折中最常見的主要癥狀。骨小梁評分近年來也發展成為一種判斷骨折風險的重要參考依據，骨小梁水平越高，患骨質疏松性骨折的概率便越低。同時，前人研究發現，miR-125b對成骨細胞的分化具有抑制作用。相似地，miR-125a-3p經報道可以抑制成骨細胞增殖與分化，而且可以促進破骨細胞生成。而成骨細胞在骨形成、發育、重塑和修復過程中起著重要作用。與miR-125a-3p相反，Notch受體在骨骼發育和內環境穩態中起重要作用，在骨細胞中，Notch激活可提高骨質量。同時，Notch可以抑制骨的再吸收，增加骨骼體積和質量，促進骨骼發展成熟。

此外，本研究發現抑制miR-125a-3p可促進BMP-2在骨質疏松性骨折大鼠中的陽性表達，而抑制Notch1則會導致相反趨勢。BMP-2，即骨形成蛋白2，因在誘導成骨再生中發揮重要作用得以廣泛應用。BMP-2能促進骨髓間充質干細胞的成骨分化，促進早期的骨形成和骨骼再生。有研究表明，上調Notch-1表達可以促進BMP-2表達。類似的，在脂多糖刺激下，Notch1表達及BMP-2表達升高，進而促進人主動脈瓣間質細胞的促成骨反應。此外，通過聯合實驗，本研究發現抑制miR-125a-3p可提高骨質疏松性骨折大鼠的骨密度以及骨生物力，相應地，抑制Notch-1表達后，大鼠的骨密度和骨生物力相關指標，包括最大負載、極限應力及剪切應力，均顯著降低。上述結果證實了抑制miR-125a-3p或促進Notch-1表達可促進骨質疏松性骨折大鼠的骨骼修復。

綜上所述，本研究發現miR-125a-3p可與Notch-1靶向結合，進而導致骨細胞缺失，骨小梁減少，同時阻礙骨再生進程。此研究發現為miRNA在治療骨關節類疾病的臨床應用提供了新的理論依據。以往研究中，關于miR-125a-3p在骨再生以及骨質量方面的研究較少，希望未來能有更多研究能證實我們的研究發現，并為骨質疏松性骨折治療開發新的有效方案。