兒童閉塞性細支氣管炎支氣管肺泡灌洗液基質金屬蛋白酶9、抗菌肽37、中性粒細胞與氣道炎癥程度的關系

閉塞性細支氣管炎（Bronchiolitis obliterans， BO）是一種小氣道損傷所致慢性氣流受限綜合征，成人常見于肺移植后，兒童BO常繼發于下呼吸道病毒感染。統計資料顯示，BO病人3年病死率達60%以上，存活者仍伴反復性氣促、喘息等，易繼發嚴重感染，需反復住院治療，嚴重威脅病人生命。目前BO缺乏特異性診斷手段，且國內相關研究起步較晚，多數醫師對其認識不夠，常被誤診為非典型兒童慢性阻塞性肺病，在肺已發生不可逆性纖維化表現時才引起重視，未能早期診斷、治療是致預后不良的關鍵。相關研究已證實，氣道上皮細胞損害是BO發病始動者，同時伴多因素刺激，大量炎癥細胞活化、炎癥細胞因子分泌造成細支氣管上皮細胞壞死、脫落、成纖維細胞增殖及纖維化形成病理性改變?；|金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase，MMP-9）是明膠酶家族成員，正常情況組織表達量極少，特定條件下MMP-9表達失衡可誘發多種疾病及組織纖維化病理改變；抗菌肽37、中性粒細胞與多種呼吸系統疾病發生關系密切。本研究首次探討兒童BO支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞與氣道炎癥程度的關系，旨在為臨床診斷提供循證依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河南省兒童醫院2018年1月至2019年6月BO病兒42例作為觀察組，另選擇該院同期支氣管異物無并發感染病兒38例作為對照組。符合BO診斷標準；兩組年齡、性別、體質量指數基礎資料參見后述表2，經統計均衡可比（

P

＞0.05）。病兒監護人或其近親屬對病兒所受治療知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。納入標準：①胸部CT示馬賽克灌注征，急性下呼吸道感染或急性肺損傷后6周以上持續或反復性喘息、咳嗽或氣促、呼吸困難、喘鳴，支氣管擴張劑治療無效。②胸X線片與臨床表現輕重不符。排除標準：①原發性纖毛運動障礙、支氣管哮喘等肺部疾病。②先天性心臟病、免疫缺陷疾病。

1.2 方法

纖支鏡檢查：手術室靜脈麻醉輔助實施纖支鏡檢查，支氣管鏡（日本東芝公司）經喉罩進入，觀察病兒氣道、左右側各葉、段支氣管情況及黏膜、分泌物性狀，取分泌物實施病原學診斷；采取生理鹽水1 mL/kg沖洗支氣管，連續3次，回收液體置無菌容器，0～4℃保存待測。

灌洗液處理：首先離心10 min（4℃，3 500 r/min），分別取上清液、沉淀，分裝已備好凍存管內，-80℃超低溫冰箱保存備用。

酶聯免疫吸附測定：以酶聯免疫吸附測定檢測灌洗液MMP-9、抗菌肽37、白細胞介素-17（IL-17）、白細胞介素-13（IL-13）及半胱氨酰白三烯（LTS）水平，酶聯儀于450 nm波長下檢測吸光度，參考標準物濃度計算樣品濃度。

灌洗液中性粒細胞檢測：取已制備沉淀0.5 mL于無菌試管內，加二流蘇糖醇2.5 mL溶解，加2.5 mL冰醋酸（15%）搖勻，滴管吸取液體滴至血細胞計數板涂片，計數細胞分類及總數，涂片標準計數200個細胞，低倍鏡中性粒細胞＞45個。

1.3 觀察指標

（1）對比兩組支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞含量。（2）分析支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞與兒童BO的關系。（3）對比不同病情程度病兒支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞含量。（4）對比不同病情程度病兒氣道炎癥因子（IL-17、IL-13、LTS）水平。（5）Pearson相關性分析檢驗MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞與氣道炎性因子（IL-17、IL-13、LTS）相關性。病情程度判定標準見表1。

表1 閉塞性細支氣管炎病情程度判定標準

2 結果

2.1 兩組基線資料及支氣管肺泡灌洗液MMP

-

9、抗菌肽37、中性粒細胞含量的比較

兩組基線資料（性別、年齡、體質量指數）比較，均差異無統計學意義（

P

＞0.05）。觀察組支氣管肺泡灌洗液MMP-9、中性粒細胞含量高于對照組，抗菌肽37含量低于對照組（

P

＜0.05），見表2。

2.2 支氣管肺泡灌洗液MMP

-

9、抗菌肽37、中性粒細胞與兒童BO的關系

建立非條件logistic回歸模型，以本研究資料為樣本，以BO情況為因變量，賦值1=BO，0=非BO。以前述單因素分析（表2）中P＜0.10的指標/因素為自變量，共3個。該3指標均為連續數值資料，為提高統計效率并使回歸結果清晰，按兩組總均值進行分段（分層），轉化成兩分類變量。各變量賦值見表3。回歸結果：3個自變量均被保留入回歸方程（

P

＜0.05）。提示：支氣管肺泡灌洗液的MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞水平是兒童BO情況的影響因素或關聯影響因素。詳見表3。此外，本次回歸的廣義決定系數Cox-Snell

R

=0.513，不算太高，提示其變異被回歸模型解釋的比例不是太大，模型預測的準確性稍差。

表2 兩組基線資料及支氣管肺泡灌洗液基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、抗菌肽37、中性粒細胞含量的比較

表3 支氣管肺泡灌洗液基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、抗菌肽37、中性粒細胞與兒童患閉塞性細支氣管炎的logistic回歸結果

2.3 不同病情程度病兒支氣管肺泡灌洗液MMP

-

9、抗菌肽37、中性粒細胞含量

進一步探討不同病情程度病兒支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞含量的差別，采用單因素方差分析，結果各指標整體差異有統計學意義（

P

＜0.05）。多重比較并結合主要數據分析：重度病兒支氣管肺泡灌洗液MMP-9、中性粒細胞含量高于中度、輕度病兒，抗菌肽37低于中度、輕度病兒（

P

＜0.05），詳見表4。

表4 不同病情程度閉塞性細支氣管炎病兒支氣管肺泡灌洗液基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、抗菌肽37、中性粒細胞含量比較/±s

2.4 不同病情程度病兒氣道炎癥因子水平

仿前行單因素方差分析，不同病情程度病兒支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-13、LTS含量相比，差異有統計學意義（

P

＜0.05）；多重比較并結合主要數據分析：重度病兒支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-13、LTS含量高于中度、輕度病兒（

P

＜0.05），見表5。

2.5 MMP

-

9、抗菌肽37、中性粒細胞與氣道炎性因

子相關性

Pearson相關性分析，MMP-9（

r

=0.696；

r

=0.615；

r

=0.612）、中性粒細胞（

r

=0.674；

r

=0.474；

r

=0.826）與IL-17、IL-13、LTS呈正相關，抗菌肽37（

r

=-0.762；

r

=-0.617；

r

=-0.685）與IL-17、IL-13、LTS呈負相關（

P

＜0.05）。

表5 不同病情程度閉塞性細支氣管炎病兒氣道炎癥因子水平比較（-x±s）

3 討論

目前肺活檢是BO診斷的“金標準”，但小兒受肺組織嬌嫩、各項生理機能發育不完善等因素影響，肺活檢困難。臨床報道，眾多生理、病理過程參與BO發病，如肺組織修復、重建、血管形成、炎癥反應等。因此，細胞相關因子診斷BO是當前研究熱點。

MMP-9是明膠酶家族主要成員，負責水解變性膠原，主要由內皮細胞、巨噬細胞、肺泡上皮細胞生成，在所有MMPs成員中，僅MMP-9可特異性降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原、巢蛋白。基礎研究顯示，MMP-9與其抑制因子表達失衡是哮喘、肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系統纖維化疾病主要危險因素。BO進展過程中肺纖維化是其主要病理變化，本研究檢測發現，BO病兒支氣管肺泡灌洗液MMP-9水平高于支氣管異物病兒（

P

＜0.05），與劉會青等研究結果近似。此外，本研究還對不同病情程度BO病兒進行研究發現，隨病情程度加重，支氣管肺泡灌洗液MMP-9水平呈升高趨勢，與氣道炎性因子IL-17、IL-13、LTS呈正相關（

P

＜0.05），推測MMP-9參與BO發病過程，并通過介導炎癥損害，加重BO病情。MMP-9酶解活性可破壞細胞基底膜完整性，刺激成纖維細胞入侵肺組織，激活肺組織炎癥細胞，進一步損害肺組織。但有研究顯示，肺移植后BO病人并未發現灌洗液MMP-9持續升高現象。本研究結果與此不符，究其原因可能是：（1）不同病因致病機制不盡相同，移植后BO主要為慢性排異反應致肺纖維化，而兒童BO主要與反復感染有關；（2）兩者可能處于不同疾病發展階段，雖氣道重塑是組織破壞與重構同時進行的階段，但肺部纖維化初級階段主要以基質、間質破壞為主，本研究所選病例為首次確診病兒，可能處于相對早期階段，MMP-9相關炎癥反應活躍?？咕?7是具有極強抗菌活性的內源性物質，具有廣譜抗菌、強堿性、熱穩定性等特征，尤其對革蘭氏陰性/陽性菌、真菌等菌種殺傷效果明顯，但機體出現免疫相關疾病時可致抗菌肽37表達異常。有學者研究顯示，在過敏性皮炎、哮喘、肺部炎癥病人中，外周血抗菌肽37明顯降低，原因在于呼吸道炎癥誘導痰液內中性粒細胞水平升高，并強化炎癥細胞活性，介導炎癥瀑布效應，參與疾病進展，抗菌肽37抗菌效果削弱。本研究結果顯示，觀察組支氣管肺泡灌洗液抗菌肽37含量低于對照組，中性粒細胞含量高于對照組（

P

＜0.05），與上述研究變化趨勢一致。IL-17、IL-13、LTS是重要炎癥標志物，多篇文獻證實，在BO病人痰液、支氣管肺泡灌洗液中明顯升高，且與肺功能相關，可在一定程度上反映BO病情程度。本研究還發現，支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-13、LTS水平與中性粒細胞呈正相關，與抗菌肽37呈負相關（

P

＜0.05），說明抗菌肽37、中性粒細胞與BO病兒氣道炎癥程度關系密切。分析作用機制可能是：BO病兒受病毒侵襲，機體固有免疫紊亂表現自然殺傷細胞數降低，抗菌肽37消耗加劇，同時中性粒細胞等炎癥細胞功能異常激活，持續分泌IL-17、IL-13、LTS炎性因子，且樹突狀細胞成熟障礙進一步加重肺損害。

綜上可知，BO病兒存在呼吸道MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞表達異常，其表達異常程度升高可能會加重氣道炎癥程度，可為臨床診斷、制定治療方案提供新方向。