Nod樣受體蛋白-3炎性小體在慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道重塑中的作用

慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）是以氣流受限持續存在為特征性病變的氣道慢性炎癥疾病，隨著疾病的進展，肺功能進行性減退，急性發作事件增加，其中的一個重要原因是慢阻肺的氣道重塑。氣道重塑即氣道結構的改變，主要病理改變是氣管壁的增厚及氣管平滑肌細胞的增殖，其主要發生機制目前認為是慢性炎癥的反復破壞。Nod樣受體蛋白-3（Nod-like receptor protein-3，NLRP3）近來認為在慢阻肺、支氣管哮喘等疾病的持續惡化中起關鍵作用，它被激活是疾病發生發展的主要原因。本研究于2018年7月至2019年3月通過制備慢阻肺大鼠模型，檢測外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA相對表達量、肺泡灌洗液炎性因子水平及大鼠氣管平滑肌厚度，以探討它們間的關系。

1 材料與方法

1.1 動物

24只1月齡清潔級Wistar大鼠，體質量范圍為220～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［許可證SCXK（滬）2017-0005］。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 主要試劑

內毒素（西格瑪公司）；SYBR

Premix Ex Taq

?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）RR420A（TAKARA公司）；TRIzol Reagent（Ambion公司）；紅梅牌香煙（紅塔集團）。

1.3 主要儀器與設備

熒光定量PCR儀（LightCycler? 96）羅氏；酶標儀（MK3）Axygen公司；酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京建成）；熏煙箱（自備）。

1.4 實驗方法

1.4.1

模型的分組和復制 將大鼠以隨機數字表法均分成空白組和慢阻肺組（各12只）。依據經典的煙熏加氣管靜滴內毒素方法復制慢阻肺模型。方法如下：第1、14天經氣道滴入1 g/L的內毒素2 000μL，后2～30 d（第14天除外），將大鼠放入5%香煙煙霧中熏0.5 h/d。

1.4.2

蘇木精-伊紅（HE）染色及支氣管平滑肌測量（1）石蠟切片制備。取材與固定→水洗→脫水→透明→透臘→包埋→切片→展片→撈片→貼片→烤片。（2）HE染色步驟。先后予二甲Ⅰ、Ⅱ苯脫蠟，續予乙醇水化，再予蘇木精染液浸泡、1%鹽酸乙醇分化、1%伊紅乙醇染色，后梯度乙醇脫水，再分別予二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，封片。（3）測量支氣管平滑肌厚度。應用Image-Pro Plus 6.0軟件測定。以管壁內周長標準化的平滑肌層面積代表平滑肌厚度。

1.4.3

實時聚合酶鏈反應（Real-time PCR）檢測大鼠外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA取大鼠外周血，分離出淋巴細胞，加入Trizol提取總RNA，逆轉錄合成互補DNA（cDNA）。將獲得的cDNA擴增目的基因。引物β-肌動蛋白（β-actin）正向：GGAGAAGATTTGGCACCACAC，反向：ACACAGCCTGGATGGCTACG，片段長度173 bp；NLRP3正向：AGCTCCTCTGTGAGGGACTT，反向：GAGCGTCACCACACACAGAT，片段長度179 bp。反應條件：95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s，共40～45個循環。上機擴增檢測，應用2法計算NLRP3 mRNA的相對表達量。

1.4.4

ELISA測定白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-18（IL-18）應用雙抗體夾心法測定肺泡灌洗液細胞因子的濃度，依試劑盒使用說明書，用酶標儀測量吸光度，后通過標準曲線計算細胞因子濃度。

2 結果

2.1 兩組身體情況對比

空白組飲食如常，行動敏捷，活躍；慢阻肺組漸漸表現為體質量下降、身懶少動、皮毛無光。

2.2 大鼠肺組織病理

光鏡下可見慢阻肺組大鼠肺組織有許多炎性細胞浸潤，以巨噬細胞為主要成分，肺泡腔內表達為主，見圖1A。空白組大鼠肺組織小氣管黏膜上皮無破損，無炎癥細胞集聚，管腔沒有滲出物，見圖1B。

2.3 兩組大鼠NLRP3 mRNA相對表達量、肺泡灌洗液炎性因子濃度及氣管平滑肌厚度水平差異

慢阻肺組外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA相對表達量、肺泡灌洗液炎性因子濃度及氣管平滑肌厚度均高于空白組（

P

＜0.05）。如表1所示。

表1 兩組大鼠Nod樣受體蛋白-3（NLRP3）mRNA相對表達量、肺泡灌洗液炎性因子濃度及氣管平滑肌厚度水平差異/±s

2.4 兩組大鼠支氣管平滑肌厚度與NLRP3 mRNA相對表達量、肺泡灌洗液炎性因子的Pearson相關性分析

氣管平滑肌厚度與外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA相對表達量的

r

值為0.799；與肺泡灌洗液IL-18的

r

值為0.938；與肺泡灌洗液IL-1β水平的

r

值為0.970。均

P

＜0.001。

3 討論

慢阻肺為呼吸系統的常見疾病，防治重點就是延緩氣道重塑的發生，減少急性加重事件的發生，改善生存質量。氣道重塑是氣流受限持續存在的病理學基礎，其基本病變為氣管平滑肌的增殖，造成氣管管腔狹窄，肺動態及過度充氣，極大影響慢阻肺的預后。氣道重塑的機制目前尚未明確，目前主流的觀點認為是慢性氣道炎癥所致。炎性小體為一種蛋白復合物，其分布于細胞質內，可以被多種內外源性分子激活。其中NLRP3炎性小體當前探討比較深入，多種外源性異物及內源性分子均可激活它，其可誘導多種成分進行組合，其中包括NLRP3，就構成了NLRP3炎性小體。NLRP3炎性小體在多種與慢性炎癥相關的疾病進程里發揮了重要的作用，如呼吸系統疾病中的慢阻肺、哮喘。目前還有學者認為，慢阻肺的發生發展，炎性小體持續被激活起了關鍵的影響。

慢阻肺是暴露于有害氣體后引起氣道的異常炎癥反應。本研究通過煙熏大鼠模擬慢阻肺的發生，并氣管內滴入內毒素刺激炎癥反應，模型大鼠的肺組織病理提示造模成功。謝圓媛等研究認為，持續存在的氣道與肺部的炎癥是導致慢阻肺病情持續惡化的重要機制，但導致炎癥發生并持續擴散的機制尚不明確。NLRP3炎性小體是機體固有免疫系統的識別受體，可通過引起炎癥細胞浸潤及炎性因子分泌參與慢阻肺的疾病進程。同時，有研究指出，慢阻肺病人病情惡化的一個重要因素，就是IL-1β、IL-18濃度升高。IL-1β是可在機體內起重要作用的炎性因子，屬IL-1亞家族成員，多種細胞如淋巴細胞、單核細胞等均能夠分泌。既往研究指出，IL-1β能激活免疫應答，使多種炎性介質及炎性細胞浸潤到支氣管黏膜。IL-18可由多種組織細胞分泌，是一種作用強大的細胞因子，可調控多種細胞的增殖及細胞因子的合成分泌。宋素莉研究指出，IL-18通過誘導多種炎性介質從而引起氣道重塑。還有研究發現，小鼠肺氣腫程度與肺組織內IL-18的表達呈正相關。本研究發現，相對于空白組，慢阻肺組外周血淋巴細胞的NLRP3 mRNA相對表達量水平升高；同時肺泡灌洗液里的IL-18、IL-1β在慢阻肺組里的濃度高于空白組。這表明，外源性信號活化NLRP3炎性小體后，有激活下游肺泡中炎性因子可能，引起氣道炎癥，促進了慢阻肺的進展，這與既往的研究相符合。本研究也表明了慢阻肺的氣管平滑肌厚度高于空白組，隨著慢阻肺疾病的發生及進展，氣管平滑肌進行性增厚，使氣道發生重塑；而氣道重塑可使肺功能的進行性下降。因此，對氣道重塑的有效干預，是防治慢阻肺及延緩其疾病進展的重要步驟。

同時，本研究采用Pearson相關分析還發現氣管平滑肌厚度與NLRP3 mRNA相對表達量及肺泡炎性因子水平有正相關，說明隨著炎癥反應的增強，慢阻肺氣道重構也隨之增強。這與既往研究一致。目前觀點認為，NLRP3炎性小體及產物，可引起慢阻肺氣道的炎性介質及細胞浸潤，并刺激氣道分泌及合成細胞外基質，促進氣管平滑肌的增殖。因此，NLRP3炎性小體可作為防治氣道重塑的一個位點。

本研究通過制備慢阻肺大鼠模型，通過檢測氣管平滑肌厚度及外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA相對表達量及肺泡灌洗液里炎性因子濃度，初步表明了NLRP3炎性小體在慢阻肺氣道重塑中的作用，為我們防治及延緩慢阻肺的發生提供了新的思路。