長鏈非編碼RNA MIR4435-2HG靶向微小RNA-1-3p調控信號通路磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B對胰腺癌細胞增殖、侵襲和遷移的機制研究

胰腺癌是一種惡性程度高的惡性腫瘤，胰腺癌早期即可發生局部浸潤及轉移。目前手術、放療等手段對胰腺癌的治療效果較差且病人生存預后差。因而從胰腺癌的發生機制方面探究有效治療胰腺癌的方法具有十分重要的意義。既往研究發現長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）可參與基因轉錄激活、調節蛋白功能及轉錄后調控等多種生物學過程，并可調控惡性腫瘤轉移及侵襲。研究表明長鏈非編碼RNA MIR4435-2HG（Long non-coding RNA MIR4435-2HG，LncRNA MIR4435-2HG）在肝細胞癌中的表達明顯增高，并可通過調控微小RNA-487a（microRNA-487a，miR-487a）表達進而促進肝細胞癌細胞增殖。但MIR4435-2HG在胰腺癌中的表達及其對胰腺癌發生發展過程的影響尚未可知。相關報道指出微小RNA-1（microRNA-1，miR-1）在胰腺癌內皮細胞中呈低表達，上調miR-1表達可以抑制胰腺癌內皮細胞遷移及血管生成。通過starBase在線網站預測到微小RNA-1-3p（microRNA-1-3p，miR-1-3p）可能是MIR4435-2HG的靶基因，然而MIR4435-2HG是否可通過調控miR-1-3p表達進而參與胰腺癌的發生發展過程尚未可知。已有報道指出磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路失活可明顯抑制胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲。然而，MIR4435-2HG是否可調控PI3K/Akt信號通路進而影響胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲仍未可知。目前國內外對MIR4435-2HG在胰腺癌發生發展中的作用機制研究相對較少，本研究于2017年1月至2018年12月通過抑制胰腺癌細胞中MIR4435-2HG表達，以研究其對胰腺癌細胞的生物學行為及PI3K/Akt信號通路的影響，并首次探討胰腺癌細胞中MIR4435-2HG與miR-1-3p的靶向調控關系及其內在作用機制，以期為揭示胰腺癌發病機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常胰腺細胞系hTERT-HPNE與胰腺癌細胞系PANC-1、SW1990、PaTu8988、Bx-PC-3均購自美國ATCC細胞庫。DMEM培養基購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶、胎牛血清均購自杭州四季青生物材料有限公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；MIR4435-2HG干擾序列（siRNA MIR4435-2HG）與siRNA control均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；miR-1-3p mimics、miR-1-3p抑制劑（anti-miR-1-3p）及其各自相應無意義序列均購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒及熒光素酶報告基因載體均購自上海碧云天生物技術有限公司；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質膠購自美國Sigma公司；兔抗人基質金屬蛋白酶2（MMP2）與基質金屬蛋白酶9（MMP9）抗體均購自美國Novus Biologicals公司；兔抗人細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、p-Akt、PI3Kp11 0α、PI3Kp110β抗體均購自美國Cell Signal Technology公司；蛋白裂解液與BCA蛋白檢測試劑盒均購自南京凱基生物技術有限公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1

細胞轉染及分組 正常胰腺細胞系hTERTHPNE與胰腺癌細胞系PANC-1、SW1990、Pa-Tu8988、BxPC-3均接種至含有10%胎牛血清的DMEM培養基的培養瓶內，放入37℃、二氧化碳體積分數5%、相對濕度95%的培養箱內培養，根據細胞生長狀態及時更換培養基，待細胞匯合度達到80%左右時，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集細胞進行傳代培養，當細胞穩定傳代2～3代后進行后續研究。選取生長狀態良好的胰腺癌PaTu8988細胞，以每孔2×10個細胞的密度接種于6孔板，放入37℃、二氧化碳體積分數5%、相對濕度95%的培養箱內培養24 h，待細胞匯合度達到50%左右時進行轉染，參照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書進行操作，將胰腺癌PaTu8988細胞按照隨機數字表法分為si-MIR4435-2HG組（轉染MIR4435-2HG siRNA）、si-con組（轉染siRNA Control）、miR-1-3p組（轉染miR-1-3p mimics）、miR-con組（轉染miR-1-3p陰性對照）、si-MIR4435-2HG+anti-miR-1-3p組（共轉染MIR4435-2HG siRNA與miR-1-3p抑制劑）、si-MIR4435-2HG+anti-miR-con組（共轉染MIR4435-2HG siRNA與miR-1-3p抑制劑的陰性對照），同時將未經任何處理的細胞作為NC組。轉染6 h后用含有10%胎牛血清的DMEM新鮮培養基更換不含血清的培養基，放入37℃、二氧化碳體積分數5%、相對濕度95%的培養箱內繼續培養48 h。

1.2.2

實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測細胞中LncRNA MIR4435-2HG與miR-1-3p的表達水平 分別收集各組細胞，用液氮低溫研磨細胞，加入1 mL Trizol試劑，室溫放置5 min后向每管酶加入200μL氯仿，上下搖晃15 s后置于室溫條件下靜置2 min，4℃，1 2000 r/min，離心10 min，吸取上層水相置于另一新的1.5 mL EP管內，加入500μL異丙醇，充分混勻后室溫靜置7 min，4℃，12 000 r/min，離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌RNA，4℃，12 000 r/min，離心10 min，棄上清，超凈工作臺干燥7 min，加入30～40μL DEPC水，置于60℃恒溫水浴鍋3 min，目的是促使RNA完全溶解，吸取2μL RNA檢其濃度。參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為互補DNA（cDNA），采用qRT-PCR檢測MIR4435-2HG與miR-1-3p的表達情況，按照實時熒光定量PCR試劑盒說明配置25μL的反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5μL，cDNA樣本2μL，正反向引物各1μL，DEPC水補足體系至25μL。反應條件為95℃2 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃20 s，循環35次，每孔均設置3個復孔，反應結束后按照2法計算MIR4435-2HG與miR-1-3p的相對表達量。

1.2.3

蛋白質印跡法（Western blotting）檢測cyclin D1、MMP2、MMP9及PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達 收集各組細胞并加入細胞裂解液，12 000 r/min轉速離心10 min收集上清液即細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，煮沸蛋白促使其變性，同時制備濃縮膠與分離膠，蛋白樣本上樣，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離蛋白，PVDF膜濕法將分離的蛋白凝膠轉移至膜上，使用蛋白封閉液室溫條件下封閉1 h，加入蛋白一抗，稀釋比均為1∶100，4℃條件下孵育過夜，次日室溫條件下分別加入二抗，孵育1 h后置于凝膠成像系統曝光，應用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4

細胞增殖實驗 收集對數生長期胰腺癌Pa-Tu8988細胞，胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，調整細胞密度為3×10/mL，以每孔4×10個細胞的密度接種于96孔板，轉染24 h、48 h、72 h時分別檢測各孔吸光度值，每組均設置3個復孔，檢測時各孔分別加入20μL MTT溶液，室溫孵育4 h后棄培養基，各孔分別加入200μL二甲基亞砜，振蕩10 min后置于酶標儀檢測490 nm處各孔吸光度值。

1.2.5

細胞遷移及侵襲實驗 轉染48 h后收集各組胰腺癌PaTu8988細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞，預冷PBS洗滌細胞，加入200μL不含血清的DMEM培養基重懸細胞，制備單細胞懸液，調整細胞密度為2×10/mL，同時用不含血清的DMEM培養基稀釋Matrigel基質膠（稀釋比1∶8），取100μL稀釋液鋪于Transwell小室底部的上室面，放入37℃、二氧化碳體積分數5%、相對濕度95%的培養箱靜置1 h。將單細胞懸液以每孔5×10個細胞的密度平鋪于Transwell小室的上室，取600μL含有10%胎牛血清的DMEM培養基加入Transwell小室的下室，放入37℃、二氧化碳體積分數5%、相對濕度95%的培養箱培養24 h，取出Transwell小室并用棉簽擦去上室細胞，多聚甲醛固定20 min后使用結晶紫溶液染色15 min，預冷PBS洗滌后置于倒置顯微鏡下觀察穿過濾膜的細胞，統計侵襲細胞數。Transwell遷移實驗中Transwell小室的上室不涂Matrigel基質膠稀釋液，其余步驟同Transwell侵襲實驗。

1.2.6

雙熒光素酶報告基因實驗 使用starbase對MIR4435-2HG和miR-1-3p結合進行預測，發現MIR4435-2HG的3"UTR上存在miR-1-3p的結合位點，提示MIR4435-2HG可能靶向結合miR-1-3p。構建含有miR-1-3p結合位點的MIR4435-2HG-3"野生型（WT-MIR4435-2HG）及突變型報告基因載體（MUT-MIR4435-2HG），同時將對數生長期的胰腺癌PaTu8988細胞以每孔2×10個細胞的密度接種于24孔板，放入37℃、二氧化碳體積分數5%、相對濕度95%的培養箱內繼續培養，轉染前3 h將培養基更換為不含血清的培養基，將miR-1-3p mimics與WTMIR4435-2HG共同轉染胰腺癌PaTu8988細胞，以共轉染miR-con為對照；將miR-1-3p mimics與MUTMIR4435-2HG共同轉染胰腺癌PaTu8988細胞，以共轉染miR-con為對照，轉染6 h后更換為含有10%胎牛血清的新鮮培養基，繼續培養48 h后，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

2 結果

2.1 qRT

-

PCR檢測胰腺癌細胞和正常胰腺細胞系中lncRNA MIR4435

-

2HG和miR

-

1

-

3p表達量

在胰腺癌細胞系中lncRNA MIR4435-2HG的表達水平較正常胰腺細胞系hTERT-HPNE明顯升高（

P

＜0.05），而miR-1-3p的表達水平顯著降低（

P

＜0.05），其中在胰腺癌PaTu8988細胞中miR-1-3p的表達水平降低最為明顯，因此選取胰腺癌PaTu8988細胞進行后續研究，見表1。

表1 胰腺癌細胞系PANC-1、SW1990、PaTu8988、BxPC-3和正常胰腺細胞系hTERT-HPNE中lncRNA MIR4435-2HG和miR-1-3p表達量比較/±s

2.2 敲低MIR4435

-

2HG對PaTu8988增殖、遷移和侵襲的影響

敲低MIR4435-2HG后，觀察胰腺癌PaTu8988細胞增殖、遷移及侵襲能力改變，如圖1、表2所示，與NC組、si-con組比較，si-MIR4435-2HG組PaTu8988細胞增殖活性顯著降低（

P

＜0.05），細胞遷移及侵襲數量均明顯減少（

P

＜0.05），進一步研究結果顯示，si-MIR4435-2HG組PaTu8988細胞中cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達水平較NC組、si-con組均顯著降低（

P

＜0.05），表明敲低MIR4435-2HG可通過降低cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達進而抑制胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲。

2.3 MIR4435

-

2HG靶向miR

-

1

-

3p表達

通過starbase對MIR4435-2HG和miR-1-3p結合進行預測示意圖，見圖2。構建含有miR-1-3p結合位點的MIR4435-2HG-3"野生型（WT-MIR4435-2HG）及突變型報告基因載體（MUT-MIR4435-2HG），在細胞中轉染miR-1-3p mimics和MIR4435-2HG野生型及突變型報告基因載體，結果顯示，與miR-con組相比，轉染miR-1-3p mimics與WT-MIR4435-2HG后可明顯降低細胞熒光素酶活性（

P

＜0.05）；而轉染miR-1-3p mimics與MUT-MIR4435-2HG對細胞熒光素酶活性無明顯影響（

P＞

0.05），見表3。表明MIR4435-2HG可靶向結合miR-1-3p。qRT-PCR實驗檢測MIR4435-2HG過表達或抑制其表達后，胰腺癌Pa-Tu8988細胞中miR-1-3p的表達水平，結果顯示，與si-con組（0.96±0.09）相比，si-MIR4435-2HG組胰腺癌PaTu8988細胞中miR-1-3p的表達水平（2.19±0.23）顯著升高（

P

＜0.05）；與pcDNA-con組（0.99±0.11）相比，pcDNA-MIR4435-2HG組胰腺癌Pa-Tu8988細胞中miR-1-3p的表達水平（0.45±0.05）顯著 降 低（

P

＜0.05），

F

=86.417，

P

＜0.001。表 明MIR4435-2HG可負向調控靶基因miR-1-3p的表達。

表2 敲低MIR4435-2HG對PaTu8988胰腺癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響研究/±s

圖2 MIR4435-2HG靶向miR-1-3p表達，生物信息軟件預測MIR4435-2HG與miR-1-3p靶向關系

表3 miR-con或miR-1-3p與報告質粒共轉染PaTu8988細胞后雙熒光素酶活性檢測結果比較/±s

2.4 高表達miR

-

1

-

3p對PaTu8988增殖、侵襲和遷移的影響研究

胰腺癌PaTu8988細胞中上調miR-1-3p表達后，觀察細胞增殖、遷移及侵襲能力，結果顯示，相較于NC組、miR-con組，miR-1-3p組胰腺癌PaTu8988細胞增殖活性顯著降低（

P

＜0.05），遷移及侵襲細胞數均顯著減少（

P

＜0.05），能夠明顯抑制cyclin D1、MMP2、MMP9表達（

P

＜0.05），見圖3、表4。表明胰腺癌細胞中上調miR-1-3p表達可通過下調cyclin D1、MMP2、MMP9表達進而減弱胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。

圖3 高表達miR-1-3p蛋白質印跡法檢測cyclin D1、MMP2、MMP9的蛋白表達

2.5 PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達

Western blotting實驗檢測敲低MIR4435-2HG及上調miR-1-3p后胰腺癌PaTu8988細胞中PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達，如圖4、表5所示，與si-con組相比，si-MIR4435-2HG組 與miR-1-3p組p-Akt、PI3Kp110α、PI3Kp110β的蛋白表達水平均顯著降低（

P

＜0.05），表明敲低MIR4435-2HG或上調miR-1-3p表達均可抑制PI3K/Akt信號通路活化。

圖4 Western blotting檢測敲低MIR4435-2HG及上調miR-1-3p后胰腺癌PaTu8988細胞中磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路相關蛋白表達

表5 Western blotting檢測敲低MIR4435-2HG及上調miR-1-3p后胰腺癌PaTu8988細胞中磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路相關蛋白表達比較/±s

2.6 miR

-

1

-

3p低表達可以部分逆轉MIR4435

-

2HG低表達對PaTu8988增殖、侵襲和遷移的影響

為了驗證敲低MIR4435-2HG是否可通過調控miR-1-3p表達進而對胰腺癌PaTu8988細胞增殖、遷移及侵襲發揮抑制作用，將si-MIR4435-2HG與antimiR-1-3p、anti-miR-con分別共轉染入胰腺癌Pa-Tu8988細胞，如圖5、表6所示，與si-MIR4435-2HG+anti-miR-con組相比，si-MIR4435-2HG+anti-miR-1-3p組胰腺癌PaTu8988細胞增殖活性明顯增強（

P

＜0.05），遷移及侵襲細胞數均明顯增加（

P

＜0.05），明顯促進cyclin D1、MMP2、MMP9表達（

P

＜0.05）。表明抑制miR-1-3p表達可部分逆轉敲低MIR4435-2HG表達對胰腺癌PaTu8988細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

表4 高表達miR-1-3p對PaTu8988胰腺癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響研究/±s

圖5 Western blotting檢測cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達

3 討論

進展期或晚期胰腺癌病人對化療藥物具有一定耐藥性而降低治療效果，病人經治療后生存率極低。因而探究胰腺癌發病機制及其可能作用分子靶點對提高胰腺癌早期診斷及治療均具有重要意義。目前LncRNA可通過調控細胞分化、發育等過程進而在多種腫瘤細胞中發揮重要作用，并可為腫瘤治療提供新方向。有研究表明LncRNA MALAT1可通過調控miR-204表達進而參與胰腺癌發生及發展過程，并可能作為胰腺癌靶向治療的靶點。但LncRNA與胰腺癌發展進程的相關研究尚未完全闡明，因此繼續深入挖掘新型LncRNA分子并探討其與胰腺癌細胞惡性生物學行為的相關性對提高治療效果及改善病人預后均具有重要臨床意義。

MIR4435-2HG在肺癌細胞中呈高表達，并可通過激活β-連環蛋白信號傳導可促進肺癌進展。胃癌病人血漿中MIR4435-2HG的表達水平升高并可作為早期胃癌診斷的分子標志物。Ouyang等研究表明MIR4435-2HG在結直腸癌病人中呈高表達，其高表達量與病人預后不良有關，并可作為預測病人預后的獨立預測因子。以上研究表明MIR4435-2HG可能作為癌基因參與腫瘤細胞增殖、遷移等多種生物學過程，因此本研究探討MIR4435-2HG在胰腺癌細胞中的具體作用，研究結果發現，胰腺癌細胞系中MIR4435-2HG的表達水平均顯著升高，進一步通過敲低MIR4435-2HG表達，結果發現胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯受到抑制，并可降低cyclin D1、MMP2、MMP9表達，說明MIR4435-2HG在胰腺癌生物學行為中發揮重要作用。既往研究表明腫瘤增殖、遷移及侵襲與胰腺癌轉移早、進展快等有關，抑制cyclin D1、MMP2、MMP9表達可抑制胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲。提示抑制MIR4435-2HG表達可通過影響細胞增殖、遷移及侵襲相關蛋白表達進而影響胰腺癌惡性生物學行為。生物信息學檢測發現MIR4435-2HG與miR-1-3p存在相互作用，但其具體作用機制尚未可知。既往研究報道指出miR-1-3p可通過調控BDNF-TrKB信號通路及其他相關蛋白表達進而抑制膀胱癌細胞增殖及侵襲。Wang等研究表明miR-1-3p通過靶向DKK1進而抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖及遷移。本研究發現miR-1-3p在胰腺癌細胞中的表達水平明顯降低，提示miR-1-3p可能作為抑癌因子參與胰腺癌發生過程。雙熒光素酶報告實驗證明MIR4435-2HG可靶向結合miR-1-3p，上游MIR4435-2HG可負向調控miR-1-3p表達，同時miR-1-3p可通過逆向調控MIR4435-2HG的表達進而對胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲進行雙向調控，說明敲低MIR4435-2HG表達可通過調控miR-1-3p表達進而抑制胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲。提示MIR4435-2HG可通過與miR-1-3p相互作用進而參與胰腺癌發生及發展過程，其可作為胰腺癌早期診斷的分子標志物及治療靶點。

PI3K/Akt信號通路可參與腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲等生物學過程，腫瘤細胞接受生長因子刺激后可活化受體酪氨酸酶并與PI3K結構中的p85亞基結合進而改變PI3K構象，同時可激活Akt等發生磷酸化進而促使其由細胞質轉移至細胞核內最終促使靶基因MMP-2、cyclin D1等進行轉錄。劉江波等研究表明阻斷PI3K/Akt信號通路可通過抑制細胞遷移及侵襲相關蛋白表達進而抑制胰腺癌細胞遷移及侵襲。相關研究報道指出激活PI3K/Akt信號通路可促進胰腺癌細胞遷移及侵襲能力。本研究結果發現胰腺癌細胞中抑制MIR4435-2HG表達及miR-1-3p過表達后能夠明顯降低p-Akt、PI3Kp110α、PI3Kp110β蛋白表達水平，與相關研究報道相似。說明抑制MIR4435-2HG表達及miR-1-3p過表達均可抑制PI3K/Akt信號通路激活。提示當機體遭受外界因素干擾或自身微環境變化時MIR4435-2HG表達上調而抑制miR-1-3p表達進而促進機體處于病理狀態，并可破壞細胞自身平衡狀態進而促使胰腺癌細胞突變導致細胞生物學行為發生改變。

表6 MTT法檢測細胞增殖、Transwell檢測細胞侵襲和遷移及相關蛋白表達比較/±s

綜上所述，MIR4435-2HG在胰腺癌細胞中呈高表達，而miR-1-3p呈低表達，MIR4435-2HG可通過與miR-1-3p相互作用進而促進胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，推測其原因可能與PI3K/Akt信號通路活化狀態有關，可為胰腺癌早期診斷及靶向治療提供參考依據。但關于miR-1-3p是否通過調控下游靶基因表達進而構建MIR4435-2HG/miR-1-3p/靶基因網絡均未可知，推測胰腺癌發生及發展過程中可能存在MIR4435-2HG/miR-1-3p/靶基因調控網絡，但仍需進一步研究證實。