白細胞介素-18抑制肝癌細胞增殖、促進細胞凋亡的機制研究

肝癌是臨床常見消化系統惡性腫瘤，其病死率及患病率極高，以腫瘤細胞高度轉移性及侵襲性為主要病理基礎特征，由于肝癌發病較隱匿導致病人確診時已處于肝癌晚期導致手術治療效果差。因而探討肝癌細胞增殖及凋亡的機制對肝癌分子診斷及靶向治療均具有重要意義。白細胞介素-18（IL-18）主要是由單核巨噬細胞等產生且具有多種生物活性，研究表明IL-18可通過促進NK細胞等產生炎性因子進而參與感染、腫瘤等多種生理病理過程。相關研究發現IL-18可通過調控腫瘤細胞增殖及遷移進而抑制腫瘤發生及發展過程。研究表明IL-18在肝癌組織及細胞株中不表達或少量表達，并與肝細胞肝癌的發生密切相關。IL-18能夠通過啟動經典的凋亡途徑誘導舌鱗癌細胞凋亡。然而，關于IL-18在肝癌發生及發展過程中的作用機制尚未可知。柴紅濤等研究表明Wnt/β-連環素（β-catenin）信號通路活化可促進肝癌等多種惡性腫瘤發生及發展。研究表明維生素K2可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制肝癌細胞的增殖及侵襲能力，誘導細胞凋亡。IL-18是否可通過調控Wnt/β-catenin信號通路影響肝癌細胞生物學行為尚未可知。本研究于2018年10月至2019年9月通過構建IL-18過表達載體觀察IL-18表達變化對肝癌細胞增殖、凋亡的影響及其與Wnt/β-catenin信號通路的作用關系，為臨床診斷及治療肝癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肝癌細胞株HepG2、Bel-7402購自美國典型培養物保藏中心；正常肝細胞株L02購自中國典型培養物保藏中心。胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養基、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測試劑盒購自美國Promega公司；膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙錠（PI）細胞凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；pcDNA3.1載體與脂質體Lipofectamine2000轉染試劑均購自美國Invitrogen公司；IL-18、Bax、Bcl-2、β-catenin、Cyclin D1一抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；HRP標記的二抗購自北京中橋金衫生物公司；二甲基亞砜（DMSO）購自北京普博欣生物科技有限責任公司；Trizol、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；Wnt/β-catenin通路激活劑（SKL2001）購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1

細胞培養、轉染及分組 用含有10% FBS的RPMI 1640培養液培養HepG2、Bel-7402、L02細胞，放入37℃、二氧化碳體積分數5%恒溫培養箱內培養，胰蛋白酶消化細胞，細胞融合度達到80%時進行傳代培養。收集對數生長期HepG2細胞接種于6孔板，轉染前1 d更換不含胎牛血清RPMI 1640培養液，構建真核表達質粒pcDNA3.1-IL-18（擴增IL-18基因序列，擴增區為IL-183"非翻譯區（UTR）的5"端63 bp至3"端871 bp，IL-18基因克隆到T-Vector，測序驗證，用XbaⅠ與BamHⅠ雙酶切連接至XbaⅠ與BamHⅠ雙酶切的pcDNA3.1（+）得到pcDNA3.1-IL-18），分別將空載體（pcDNA3.1）與pcDNA3.1-IL-18轉染至HepG2細胞，分別為pcDNA組、pcDNA-IL-18組。為了驗證IL-18是否通過抑制Wnt/β-catenin通路發揮作用，因此本研究在pcDNA-IL-18組HepG2細胞中加入濃度為20μmol/L的SKL2001（pcDNA-IL-18+SKL2001組）。每組均設置5個復孔。同時將正常培養的HepG2細胞作為Blank組。

1.2.2

qRT-PCR檢測細胞中IL-18、Bax、Bcl-2mRNA表達水平 按照Trizol法提取細胞總RNA，測定RNA濃度與純度，取1μg RNA為模板按照逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為互補DNA（cDNA），反應條件：37℃15 min，85℃30 s。IL-18引物由上海生物工程股份有限公司合成，采用qRT-PCR檢測試劑盒，IL-18正向引物為5"-CGTTGTCACAGATAAAGAGCCAG-3"，反向引物為5"-TGACCAGGAGAGTGTACGACG-3"；Bax正向引物為5"-TTTCTGACGGCAACTTCAACTG-3"，反向引物為5"-CAACCACCCTGGTCTTGGAT-3"；Bcl-2正向引物為5"-CGCAGAGGGGCTACGAGT-3"，反向引物為5"-GTTGACGCTCTCCACACACAT-3"。按照說明書配反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10μL，cDNA 2μL，上反向引物各0.8μL，ROX Reference Dye（50×）0.4μL，雙蒸水（ddHO）6μL以此檢測IL-18、Bax、Bcl-2 mRNA的表達；反應條件：95℃5 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，共30個循環，IL-18、Bax、Bcl-2均以GAPDH為內參，使用ABI 7500熒光定量PCR儀分析軟件對實驗數據進行分析，以2法計算IL-18、Bax、Bcl-2的相對表達量。

1.2.3

蛋白質印跡法（Western blotting）檢測IL-18、Bax、Bcl-2、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達 預冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細胞后分別加入RIPA蛋白裂解液（400μL），裂解時間為30 min，4℃條件下經離心機離心30 min，提取細胞總蛋白，配置SDSPAGE凝膠，分別取蛋白樣品與上樣緩沖液混合液上樣，電泳反應條件依次為80 V 30 min，120 V 90 min，根據marker位置切膠并應用濕轉膜儀將蛋白凝膠轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），依次加入5%脫脂奶粉、1×TBS、吐溫-20（0.1%）室溫條件下封閉3 h，分別加入IL-18（1∶400）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、β-catenin（1∶500）、Cyclin D1（1∶500）一抗，TBST洗膜，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL發光顯影，置于凝膠成像分析系統及應用Quantityone軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.2.4

MTT檢測細胞增殖 收集各組對數生長期HepG2細胞，胰蛋白酶消化后以每孔100μL體積接種至96孔板（濃度為3×10/L），在37℃、二氧化碳體積分數5%、相對濕度95%的培養箱內培養24 h、48 h、72 h，分別加入MTT試劑（20微升/孔），繼續培養4 h，棄上清，每孔分別加入150μL DMSO，搖床振蕩10 min后應用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔相對吸光度。

1.2.5

Annexin V-FITC/PI染色檢測細胞凋亡 收集各組對數生長期HepG2細胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞并調整細胞密度為1×10/L，PBS清洗，棄上清，分別加入預冷的100μL結合緩沖液懸浮細胞，依次加入10μL Annexin V-FITC與10μL PI，混勻后避光孵育15 min，應用CytoFLEX流式細胞儀檢測各組HepG2細胞凋亡情況。

2 結果

2.1 IL

-

18在肝癌HepG2、Bel

-

7402細胞和正常肝細胞L02中的表達

由圖1、表1可知，與正常肝細胞L02相比，肝癌HepG2、Bel-7402細胞中IL-18 mRNA及蛋白表達均顯著降低（

P

＜0.05）。HepG2細胞中IL-18 mRNA及蛋白表達水平相對較低，因此本研究選取HepG2細胞進行后續研究。

圖1 正常肝細胞L02和肝癌HepG2、Bel-7402細胞IL-18蛋白免疫印跡圖

表1 白細胞介素-18（IL-18）在肝癌HepG2、Bel-7402細胞和正常肝細胞L02中的表達/±s

2.2 過表達IL

-

18對肝癌HepG2細胞增殖的影響

HepG2細胞中轉染IL-18過表達載體（pcDNAIL-18），Western blotting檢測結果發現IL-18蛋白表達明顯升高（

P

＜0.05），表明成功提高HepG2細胞中IL-18表達。MTT實驗結果顯示，相較于pcDNA組，培養48 h、72 h時pcDNA-IL-18組HepG2細胞吸光度值均顯著降低（

P

＜0.05），見圖2、表2。表明IL-18過表達可抑制HepG2細胞增殖。

圖2 各組肝細胞IL-18蛋白免疫印跡圖

表2 過表達白細胞介素-18（IL-18）對肝癌HepG2細胞增殖的影響/±s

2.3 過表達IL

-

18對肝癌HepG2細胞凋亡的影響

采用流式細胞儀檢測HepG2細胞凋亡情況，Blank組、pcDNA組、pcDNA-IL-18組HepG2細胞凋亡率分別為（5.87±0.19）%、（6.93±0.22）%、（20.54±3.97）%（

F

=190.070，

P

＜0.001），pcDNA-IL-18組HepG2細胞凋亡率顯著高于pcDNA組（

P

＜0.05），見圖3。

2.4 過表達IL

-

18對肝癌HepG2細胞凋亡相關基因表達的影響

為明確IL-18是否通過調控線粒體凋亡途徑進而促進肝癌HepG2細胞凋亡，采用qRTPCR與Western blotting分別檢測HepG2細胞中促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA及蛋白表達，結果顯示pcDNA-IL-18組HepG2細胞Bax mRNA及蛋白表達均顯著高于pcDNA組（

P

＜0.05），而Bcl-2 mRNA及蛋白表達均顯著降低（

P

＜0.05），見圖4、表3。表明IL-18可通過上調Bax表達及下調Bcl-2表達進而激活線粒體凋亡途徑促進細胞凋亡。

2.5 過表達IL

-

18對肝癌HepG2細胞Wnt/

β

catenin通路的影響

用Western blotting檢測Wnt/β-catenin通路相關蛋白β-catenin、Cyclin D1表達，結果發現pcDNA-IL-18組HepG2細胞β-catenin、Cyclin D1蛋白表達均顯著低于pcDNA組（

P

＜0.05），見圖5、表4。表明IL-18可能通過抑制Wnt/β-catenin通路進而參與肝癌發生及發展過程。

圖4 各組肝細胞Bax、Bcl-2蛋白免疫印跡圖

表3 過表達白細胞介素-18（IL-18）對肝癌HepG2細胞凋亡相關基因表達的影響/±s

圖5 各組肝細胞β-catenin、Cyclin D1蛋白免疫印跡圖

表4 過表達白細胞介素-18（IL-18）對肝癌HepG2細胞Wnt/β-catenin通路的影響/±s

2.6 Wnt/

β-

catenin通路激活劑（SKL2001）逆轉了過表達IL

-

18對肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的作用

為了驗證IL-18是否通過抑制Wnt/β-catenin通路而發揮作用，在HepG2細胞中轉染pcDNA-IL-18 12h后加入Wnt/β-catenin通路激活劑（SKL2001），結果顯示，IL-18過表達后細胞吸光度明顯降低（

P

＜0.05），而細胞凋亡率明顯升高（

P

＜0.05），但加入SKL2001激活劑后，與pcDNA-IL-18組相比，pcDNAIL-18+SKL2001組HepG2細胞吸光度明顯增加（

P

＜0.05），而細胞凋亡率顯著降低（

P

＜0.05），見表5。表明IL-18可通過抑制Wnt/β-catenin通路進而抑制HepG2細胞增殖，促進細胞凋亡。

表5 SKL2001逆轉了過表達白細胞介素-18（IL-18）對肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的作用/±s

3 討論

肝癌早期診斷及治療手段均逐步提高但治療效果不佳，因而積極預防與尋找有效治療方法成為重點問題。肝癌細胞增殖與凋亡失衡是促進該疾病發生及發展的重要原因，通過抑制肝癌細胞增殖并促進細胞凋亡是干預癌癥進展的有效手段。研究表明Th1、Th2等免疫微環境細胞因子表達異常可參與多種腫瘤發生及發展過程。因此積極探究與肝癌發生密切相關的細胞因子對肝癌精準治療及提高病人生存率均具有重要意義。

IL-18主要作用于NK細胞、B細胞及T細胞，研究顯示IL-18在卵巢癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤細胞中均呈低表達，上調IL-18表達可抑制腫瘤發生及發展，進一步探究其可能作用機制為IL-18可通過調節Th1/Th2細胞分化過程并促進由Fas-FasL介導的細胞凋亡過程進而導致腫瘤細胞凋亡。但不少研究顯示IL-18可通過促進腫瘤新生血管生成進而促進腫瘤發生及發展。然而，IL-18在肝癌發生及發展過程中的作用尚未完全闡明。本研究結果顯示肝癌HepG2、Bel-7402細胞中IL-18均呈低表達，預實驗結果中IL-18在肝癌HepG2細胞中的表達相對較低，因此在HepG2細胞中轉染IL-18過表達質粒，初步分析IL-18過表達對肝癌細胞增殖及凋亡的影響，結果顯示IL-18過表達后HepG2細胞增殖活性明顯降低，而細胞凋亡率明顯升高，進一步分析細胞凋亡相關蛋白表達結果發現IL-18過表達后HepG2細胞Bax表達上調，而Bcl-2表達下調，細胞凋亡受Bax、Bcl-2蛋白調控，Bcl-2/Bax與Bcl-2/Bcl-x1形成二聚體時可抑制細胞凋亡，而Bax自身形成二聚體時可通過激活線粒體凋亡途徑進而促進細胞凋亡。提示IL-18過表達可通過激活線粒體凋亡途徑進而促進肝癌細胞凋亡，抑制細胞增殖。

Wnt/β-catenin信號通路可調節細胞增殖及黏附等多種細胞生物學行為，研究顯示Wnt/β-catenin信號通路可促進乳腺癌、肝癌及結直腸癌等多種惡性腫瘤發生及發展過程。Wnt蛋白可激活GSK-3β發生磷酸化進而促使β-catenin轉移至細胞核，并可激活下游靶基因Cyclin D1等靶基因進而增強細胞增殖及遷移能力。研究表明腫瘤細胞中β-catenin蛋白表達量升高可促進腫瘤細胞增殖并抑制細胞凋亡，其表達水平越高預示腫瘤惡性程度越高。研究表明通過抑制Wnt/β-catenin信號通路可抑制肝癌細胞增殖。由此猜測IL-18是否可通過調控Wnt/βcatenin信號通路進而參與肝癌發生及發展過程，本研究結果顯示IL-18過表達后HepG2細胞Wnt/βcatenin信號通路相關蛋白β-catenin及其下游靶基因Cyclin D1的表達水平均顯著降低，說明IL-18過表達可抑制Wnt/β-catenin信號通路活化。提示IL-18可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路進而影響肝癌發生及發展過程。同時本研究進一步驗證IL-18通過調控Wnt/β-catenin信號通路對肝癌細胞增殖及凋亡的影響，結果顯示IL-18過表達后加入Wnt/βcatenin信號通路激動劑可明顯逆轉IL-18過表達對肝癌細胞增殖的抑制及細胞凋亡的促進作用。提示IL-18可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路中βcatenin表達并下調下游蛋白Cyclin D1進而促進肝癌細胞凋亡并抑制細胞增殖。

綜上所述，IL-18在肝癌細胞中呈低表達，上調IL-18表達可通過激活線粒體凋亡途徑與抑制Wnt/β-catenin信號通路激活進而抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。然而，肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的機制尚未完全闡明，關于肝癌遷移及侵襲的分子機制仍有待研究。