原花青素通過抑制Toll樣受體4/核因子-κB信號(hào)通路對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

腦缺血再灌注（I/R）損傷是指腦缺血一段時(shí)間再灌注后，缺血組織損傷和功能障礙不僅沒有恢復(fù)，反而出現(xiàn)加重的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為血流動(dòng)力學(xué)改變、腦組織梗死面積擴(kuò)大、神經(jīng)細(xì)胞自噬和凋亡異常等現(xiàn)象。目前，臨床尚缺乏治療腦組織I/R損傷的特效藥物，防止I/R后大腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激是保護(hù)I/R損傷的重要方法之一。原花青素是一種廣泛存在于多種植物中的天然化合物，具有較強(qiáng)的清除自由基的能力和抑制凋亡的效果。但目前關(guān)于原花青素對腦I/R損傷的保護(hù)機(jī)制尚不完全統(tǒng)一。本研究于2018年6月至2019年5月旨在研究原花青素通過抑制Toll樣受體4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路對大鼠腦I/R損傷的保護(hù)作用，以期了解原花青素對大鼠I/R損傷的保護(hù)作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級3周齡SD雄性大鼠60只，體重（68.74±5.39）g，購自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，粵監(jiān)證字2004A029號(hào)，飼養(yǎng)溫度20～25℃，相對濕度50%～65%，本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 藥物與試劑

丙二醛、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、乳酸脫氫酶（Lactic dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒均購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、TLR4、NF-κB p65及NF-κB p65一抗購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶（HRP）羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo公司。

1.3 儀器

電子天平（BS-124s型），由北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司提供；低溫離心機(jī)（3-5w型），由湖南恒諾離心機(jī)有限公司提供；正置型金相顯微鏡（SG-51型），由上海光學(xué)儀器廠提供；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀由美國Bio-Rad公司提供；MF-ChemiBIS凝膠成像系統(tǒng)由以色列DNR公司提供。

1.4 分組及建立模型

將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、原花青素低劑量組和原花青素高劑量組，各15只，并采用改良線栓法制成I/R模型，模型復(fù)制和造模成功標(biāo)準(zhǔn)均參考Wu等研究。具體操作如下：麻醉大鼠并仰臥固定，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，使用微動(dòng)脈夾夾閉10 min，松開10 min，再夾閉10 min復(fù)制大鼠腦組織I/R模型。

1.5 藥物干預(yù)

原花青素低劑量組和原花青素高劑量組，分別使用原花青素灌胃處理，劑量分別為：80 mg/kg和160 mg/kg，1次/天，共處理7 d。

1.6 檢測項(xiàng)目

1.6.1

大鼠神經(jīng)功能缺損情況檢測 完成給藥12 h后，實(shí)驗(yàn)Longa 5分法評價(jià)大鼠神經(jīng)功能。

1.6.2

大鼠腦含水量檢測 神經(jīng)功能進(jìn)行評分后，斷脖處死大鼠，分離左右腦半球，快速稱質(zhì)量，計(jì)為濕質(zhì)量。將大鼠左右腦半球放入恒溫干燥箱干燥后稱質(zhì)量，計(jì)為干質(zhì)量。

1.6.3

SOD、活性氧和GPX含量檢測 斷脖處死大鼠，分離腹主動(dòng)脈血液，離心，按照試劑盒說明書檢測丙二醛、SOD、活性氧和GPX水平。

1.6.4

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達(dá)水平 取大鼠腦組織，使用胰蛋白酶消化后，提取總蛋白，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（Bcl-2、Bax、Caspase-3、TLR4和NF-κB蛋白）孵育過夜，加二抗孵育2 h，顯色后行吸光度分析，計(jì)算各蛋白相對內(nèi)參蛋白β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）的表達(dá)量。

1.6.5

大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況檢測 大鼠腦組織切片常規(guī)脫水，嚴(yán)格按照DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法（TUNEL法）試劑盒說明書進(jìn)行操作。400倍光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取皮質(zhì)區(qū)4個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞指數(shù)（Apoptosis cell index，ACI）=（凋亡細(xì)胞總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)分析采用軟件為SPSS 22.0，采用GraphPad Prism5軟件制作柱狀圖，組間比較采用單因素方差分析；若

P

＜0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損情況及腦含水量檢測結(jié)果

相比對照組，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦含水量升高（

P

＜0.05）；相比模型組，原花青素低劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦含水量降低（

P

＜0.05）；相比原花青素低劑量組，原花青素高劑量組大鼠神經(jīng)功能評分及腦含水量降低（

P

＜0.05），見表1。

表1 大鼠神經(jīng)功能缺損情況及腦含水量檢測結(jié)果/±s

2.2 大鼠氧化應(yīng)激水平檢測結(jié)果

相比對照組，模型組大鼠SOD、GPX含量水平降低、活性氧含量水平升高（

P

＜0.05）；相比模型組，原花青素低劑量組大鼠SOD、GPX含量水平升高、活性氧含量水平降低（

P

＜0.05）；相比原花青素低劑量組，花青素高劑量組大鼠SOD、GPX含量水平升高、活性氧含量水平降低（

P

＜0.05），見表2。

表2 大鼠氧化應(yīng)激水平檢測結(jié)果/（U/mL，±s）

2.3 大鼠TLR4/NF

-κ

B信號(hào)通路檢測結(jié)果

由蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)可以看出，相比對照組，模型組大鼠腦組織中TLR4蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)水平升高（

P

＜0.05）；相比模型組，原花青素低劑量組大鼠腦組織中TLR4蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)水平降低（

P

＜0.05）；相比原花青素低劑量組，花青素高劑量組大鼠腦組織中TLR4蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)水平降低（

P

＜0.05），見圖1、表3。

2.4 大鼠凋亡蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

由蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)可以看出，相比對照組，模型組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白表達(dá)降低、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)升高（

P

＜0.05）；相比模型組，原花青素低劑量組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白表達(dá)升高、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)降低（

P

＜0.05）；相比原花青素低劑量組，花青素高劑量組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白表達(dá)升高、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)降低（

P

＜0.05），見圖2、表4。

圖1 大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路檢測結(jié)果

表3 大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路檢測結(jié)果/±s

圖2 大鼠凋亡蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

表4 大鼠凋亡蛋白表達(dá)檢測結(jié)果/±s

2.5大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

由染色實(shí)驗(yàn)觀察大鼠腦細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)可以看出，相比對照組（5.01±1.21）%，模型組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目（65.58±5.32）%顯然增加（

P

＜0.05）；相比模型組，原花青素低劑量組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目（41.32±4.80）%降低（

P

＜0.05）；相比原花青素低劑量組，花青素高劑量組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目（22.14±4.09）%降低（

P

＜0.05），

F

=584.172，

P

＜0.001，見圖3。

3 討論

腦組織I/R損傷是腦動(dòng)脈缺血后恢復(fù)血流灌注時(shí)，腦組織損傷加重的現(xiàn)象，與大量炎癥介質(zhì)釋放、自由基生成、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等有關(guān)。最為顯著的表現(xiàn)為當(dāng)腦組織細(xì)胞受到損傷導(dǎo)致細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)的水分溢出導(dǎo)致腦含水量升高，神經(jīng)功能受到影響。本研究發(fā)現(xiàn)，相比模型組，原花青素低劑量組大鼠神經(jīng)功能評分及腦含水量降低。說明使用原花青素除了可以有效緩解大鼠腦I/R損傷，同時(shí)相比原花青素低劑量組，原花青素高劑量組大鼠神經(jīng)功能評分及腦含水量降低，說明在一定劑量范圍內(nèi)隨著使用原花青素處理的增加，其效果呈劑量依賴性。這可能是因?yàn)樵ㄇ嗨鼐哂幸种蒲装Y，并且通過抑制氧化反應(yīng)，緩解大鼠腦損傷。有研究表明：原花青素可以有效降低I/R大鼠腦含水量并改善神經(jīng)功能評分，本研究得出的結(jié)論與其相一致。

SOD是機(jī)體重要的過氧化物酶，可以清除體內(nèi)過量的活性氧，減少脂質(zhì)代謝中間產(chǎn)物MAD生成，減輕活性氧堆積引起的氧化應(yīng)激損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，相比模型組，使用原花青素處理的各組大鼠SOD、GPX含量水平升高、活性氧含量水平降低。說明原花青素可以有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)當(dāng)使用原花青素濃度升高后效果更為顯著。這可能是因?yàn)樵ㄇ嗨刂泻卸喾踊衔?，這些多酚化合物具有很強(qiáng)的抗氧化性，有效緩解了I/R大鼠腦組織中的過氧化反應(yīng)，緩解了大鼠的I/R損傷。

NF-κB廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，可以調(diào)節(jié)多種免疫炎癥介質(zhì)釋放，改變腫瘤生長的微環(huán)境，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)過程。等研究顯示，TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活還可以調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，相比模型組，原花青素低劑量組大鼠腦組織中TLR4蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)水平降低且Bcl-2蛋白表達(dá)升高、Bax蛋白表達(dá)也降低。說明原花青素可以抑制TLR4蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路并影響下游凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，保護(hù)大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞缺血后的凋亡，緩解了I/R損傷。有研究表明：原花青素可以抑制TLR4/NFκB信號(hào)通路，本研究結(jié)果與其基本一致。

Caspase家族基因是體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要基因，包括凋亡啟動(dòng)蛋白Caspase-9、凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3等。已有研究顯示，一旦細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)，Caspase-9可以活化Caspase-3，進(jìn)入細(xì)胞核，降解多種重要的蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中可以看出，相比模型組，原花青素低劑量組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白表達(dá)升高、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)降低。說明使用原花青素可以有效降低凋亡基因Caspase家族蛋白的表達(dá)，這可能是因?yàn)樵ㄇ嗨乜梢砸种频蛲龌蛏嫌涡盘?hào)通路，使得下游的凋亡基因表達(dá)受到抑制。李浩等研究表明：原花青素可以通過降低凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制腦細(xì)胞的凋亡實(shí)現(xiàn)保護(hù)腦I/R損傷，本研究得出的結(jié)論與其相一致。

綜上所述，原花青素過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控下游凋亡蛋白的表達(dá)抑制I/R大鼠腦細(xì)胞的凋亡緩解腦I/R損傷。但本實(shí)驗(yàn)由于經(jīng)費(fèi)和時(shí)間限制使用的大鼠有限，涉及到的預(yù)處理時(shí)間存在一定的限制，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步增加樣本量，分別在I/R前后不同的時(shí)間使用不同濃度的原花青素作用大鼠，觀察不同時(shí)間使用原花青素作用對大鼠I/R后行為學(xué)評估，腦含水量及相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)的影響。

圖3 大鼠凋亡蛋白表達(dá)檢測結(jié)果（TUNEL法×400）： A為對照組；B為模型組；C為原花青素低劑量組；D為原花青素高劑量組