基于基因組步移模塊的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)探討

李法君，付春鵬，劉 杰，李宗珍，王愛麗，喬 寧

（濰坊科技學(xué)院賈思勰農(nóng)學(xué)院，山東壽光 262700）

0 引言

作為生命科學(xué)的核心課程，生物化學(xué)主要是應(yīng)用化學(xué)的理論和方法，在分子水平上闡明生物現(xiàn)象的一門科學(xué)。它既是學(xué)習(xí)生命科學(xué)的基礎(chǔ)，又是研究生命本質(zhì)的前沿，在本科教學(xué)中起著舉足輕重的作用［1-3］。生物化學(xué)的眾多研究成果都是源于實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，因此實(shí)驗(yàn)課程是生物化學(xué)學(xué)習(xí)的重要環(huán)節(jié)［4］。而在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課中，如何提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能，加強(qiáng)對理論知識的理解和應(yīng)用；如何提升學(xué)生的創(chuàng)新能力，建立發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的思維體系，為將來的科研工作打下基礎(chǔ)，就成為當(dāng)前生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程值得思考和探究的問題。

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)通常可分為基礎(chǔ)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)和綜合性實(shí)驗(yàn)。前者實(shí)驗(yàn)結(jié)果是已知的，學(xué)生只要按照既定的實(shí)驗(yàn)步驟完成實(shí)驗(yàn)即可［5］。學(xué)生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)和思維水平的提高主要是依靠綜合性實(shí)驗(yàn)。而從實(shí)際授課情況來看，多數(shù)院校的綜合性實(shí)驗(yàn)是獨(dú)立設(shè)立的，實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之間沒有銜接性和過渡性；而且多數(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容老舊，沒有與前沿的生物化學(xué)技術(shù)接軌，學(xué)生的綜合能力得不到提高［6-7］。

基于此，團(tuán)隊(duì)成員以較為前沿的“基因組步移技術(shù)”為主線，將基因組DNA的提取、酶切連接、引物設(shè)計(jì)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等實(shí)驗(yàn)單元串聯(lián)成一個有機(jī)整體，形成一個內(nèi)容相關(guān)、層第推進(jìn)、方法多樣的綜合性實(shí)驗(yàn)，并且在實(shí)施過程中，可充分調(diào)動學(xué)生的能動性，取得良好的授課效果。

1 課程設(shè)計(jì)

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

基因組步移是指通過分子生物學(xué)手段獲得已知核酸序列的側(cè)翼未知序列技術(shù)，主要用于［8］：①根據(jù)目標(biāo)基因的cDNA序列，克隆其啟動子序列和調(diào)控序列；②鑒定轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座子的插入點(diǎn)；③染色體測序中的空隙填補(bǔ)等。目前，基于酶切連接的PCR法是最為常用的基因組步移方法。其原理是將基因組DNA 用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，然后用T4 連接酶將接頭序列加到酶切好的DNA 片段上。根據(jù)已知基因的cDNA 序列設(shè)計(jì)兩條引物（SP1 和SP2），用SP1 引物和已知的AP1 引物進(jìn)行第1 輪PCR外擴(kuò)；以外擴(kuò)PCR產(chǎn)物為模板，用SP2 引物和AP2 引物進(jìn)行第2 輪PCR 內(nèi)擴(kuò)，獲得的PCR產(chǎn)物即為目的基因［9-10］。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c材料

本實(shí)驗(yàn)以中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）的類胰島素促雄腺基因（Insulin-like androgenic gland hormone，IAG）為研究對象，通過基因組步移技術(shù)獲得Es-IAG的5'側(cè)翼序列。Es-IAG基因的cDNA序列來源于前期構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組文庫（NCBI-SRA 登錄號：SAMN06204640）［11］。

1.3 課程設(shè)計(jì)

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課授課對象為農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)專業(yè)大三本科生。課程將項(xiàng)目內(nèi)容分解為5 次課（見表1），包括4次實(shí)驗(yàn)課和1次匯報(bào)總結(jié)，課時數(shù)為12 學(xué)時，除PCR反應(yīng)為4學(xué)時外，其余均為2 學(xué)時，在固定的教學(xué)時間段內(nèi)都可完成，適合本科生的課堂教學(xué)安排。為了提高生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)效果，安排2人1組。

表1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及安排

2 實(shí)驗(yàn)過程

2.1 DNA的提取

剪切中華絨螯蟹約20 mg的肌肉組織，勻漿破碎。加入200 μL Buffer GA，20 μL Proteinase K，55 °C溫浴，將組織完全溶解。然后按DNA提取試劑盒說明進(jìn)行操作。

2.2 酶切加接頭

將DNA進(jìn)行酶切，體系如下：基因組DNA 5 μL，內(nèi)切酶1.6 μL，Buffer 2 μL，dd H2O 補(bǔ)足到20 μL。37 °C酶切過夜。將酶切后的DNA與接頭序列進(jìn)行連接反應(yīng)，體系如下：酶切產(chǎn)物4.7 μL，接頭2 μL，Buffer 0.8 μL，T4 連接酶0.5 μL，16 °C孵育1 h。

2.3 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)Es-IAG的cDNA序列，遵循引物設(shè)計(jì)的原則進(jìn)行SP1 和SP 2 引物的設(shè)計(jì)。具體序列如表2 所示。

表2 基因組步移的引物序列

2.4 基因組步移的PCR反應(yīng)

將連接液稀釋10 倍后，取1 μL 作為第1 輪反應(yīng)的模板。用SP1 于AP1 配合進(jìn)行第1 輪外擴(kuò)，然后取外擴(kuò)產(chǎn)物稀釋100 倍后，取2 μL作為第2 輪反應(yīng)的模板。PCR反應(yīng)體系如下：dd H2O 20.5 μL，PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，AP 引物0.5 μL，SP 引物0.5 μL，Polymerase Mix 0.5 μL。第1 輪反應(yīng)程序如下：7個循環(huán)：94 °C 25 s，72 °C 3 min，32 個循環(huán)：94 °C 25 s，67 °C 3 min，67 °C 終延伸7 min。第2 輪反應(yīng)程序如下：5 個循環(huán)：94 °C 25 s，72 °C 3 min，20 個循環(huán)：94 °C 25 s，67 °C 3 min，67 °C 終延伸7 min。瓊脂糖檢測反應(yīng)產(chǎn)物，然后送公司測序［12-13］。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對各個小組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較后，選取典型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。通過兩輪PCR步移反應(yīng)，獲得約1 000 bp的目的條帶（見圖1），將第2 輪PCR產(chǎn)物外送測序，測序結(jié)果如圖2 所示。

圖1 基因組步移結(jié)果

圖2 步移獲得的Es-IAG基因5'側(cè)翼序列（引物用灰色背景標(biāo)出，起始密碼子ATG用下劃線標(biāo)出）

4 教學(xué)反思

4.1 摒棄固有模式，“串”零為整

無論動物、植物還是微生物，體內(nèi)的生化反應(yīng)都是一個復(fù)雜有序的整體，都遵循“中心法則”。因此，應(yīng)該從整體水平上來看待生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程。傳統(tǒng)的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課，往往都是獨(dú)立的單元，割裂了各單元之間的聯(lián)系。這種單元化教學(xué)模式的后果往往使學(xué)生獲得的知識也呈現(xiàn)單元化，沒有形成一個整體，進(jìn)而影響了學(xué)生對生物化學(xué)理論知識的掌握，更無從談起靈活運(yùn)用生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目將基因組DNA的提取、酶切連接、引物設(shè)計(jì)和PCR 反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)單元串聯(lián)成一個整體，既考慮了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)方法的關(guān)聯(lián)性和完整性，又考慮了每個單元的相對獨(dú)立性。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，遵循循序漸進(jìn)的原則，按照“DNA提取-酶切-鏈接-引物設(shè)計(jì)-PCR反應(yīng)-測序”的順序，安排實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。上一個實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)物是下一個實(shí)驗(yàn)的原材料，環(huán)環(huán)相扣，在DNA水平將上述單元聯(lián)系在一起，突出了模塊教學(xué)的整體性，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和教學(xué)方法的有機(jī)融合。

4.2 立足發(fā)現(xiàn)、解決問題，開拓思維能力

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課除了提高學(xué)生的動手能力外，培養(yǎng)學(xué)生的發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力也是實(shí)驗(yàn)課的目標(biāo)之一。在每個實(shí)驗(yàn)之前，指導(dǎo)教師都引導(dǎo)學(xué)生閱讀相關(guān)的文獻(xiàn)資料，做到對實(shí)驗(yàn)有較為清晰的理解，掌握實(shí)驗(yàn)的基本原理，明確不同試劑在實(shí)驗(yàn)中的作用。通過查閱文獻(xiàn)使學(xué)生明確本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)中技術(shù)路線有何不同，讓學(xué)生帶著問題走進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，如在DNA 提取實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生的問題主要為柱式提取法與傳統(tǒng)的酚仿的不同點(diǎn)；在酶切連接環(huán)節(jié)，問題為完全酶切和不完全酶切對本次實(shí)驗(yàn)是否有影響；在基因組步移環(huán)節(jié)，問題為基于PCR技術(shù)的基因組步移方法有哪幾種；每種方法各自的優(yōu)缺點(diǎn)是什么。所有的問題都在匯報(bào)環(huán)節(jié)集中解決，先由學(xué)生自己根據(jù)所掌握的知識給出相應(yīng)的答案，如有不妥之處，由指導(dǎo)教師答疑釋惑。因此，模塊化的實(shí)驗(yàn)課程設(shè)置體系和循序漸進(jìn)的教學(xué)方式，不但可以使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中變被動為主動，發(fā)揮主觀能動性，逐步提高發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力；而且還可以增強(qiáng)團(tuán)隊(duì)意識和協(xié)作能力。

5 結(jié)語

生物化學(xué)是一門與時俱進(jìn)的學(xué)科，近年來由于科技不斷地發(fā)展，生物化學(xué)技術(shù)突飛猛進(jìn)，特別是分子生物學(xué)技術(shù)取得了一系列的成果，如基因編輯技術(shù)-CRISPR/Cas9 系統(tǒng)［14-15］、核糖核酸（RNA）干擾技術(shù)［16］等。隨著生物科技產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，社會對生物方面的人才需求日益增長，不僅要求具有扎實(shí)的理論基礎(chǔ)，而且更看重畢業(yè)生的“即插即用”能力。因此，不斷替換原有的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，添加前沿性的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目將是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程面臨的重要課題?；诖?，團(tuán)隊(duì)根據(jù)理論知識結(jié)合生物化學(xué)發(fā)展的現(xiàn)狀，開展了具有前沿性“基因組步移”模塊實(shí)驗(yàn)，旨在提高學(xué)生的綜合科研能力，使其所學(xué)到的知識與本領(lǐng)能為將來走上工作崗位奠定良好的基礎(chǔ)。