白藜蘆醇/富勒烯納米組裝體的制備
——在膽管支架抗炎涂層中的應(yīng)用評(píng)估

高 建，劉永佳，戚曉亮，徐汪節(jié)，喬中東

（1.上海交通大學(xué)a.生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；b.分析測(cè)試中心，上海 200240；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011）

0 引言

膽管狹窄是膽道疾病患者高發(fā)病率和高死亡率的重要原因［1］。外科手術(shù)中的膽管受損、增生性膽管炎以及惡性腫瘤是導(dǎo)致膽道狹窄的主要原因，狹窄形成與成纖維細(xì)胞增殖、膠原蛋白沉積、纖維化和腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)。處置不當(dāng)會(huì)引發(fā)胰腺炎，梗阻性黃疸等高風(fēng)險(xiǎn)疾?。?-3］。目前外科手術(shù)治療可以通過(guò)植入膽管支架直接改善膽道狹窄［4］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有30%的患者在第1次手術(shù)后出現(xiàn)了良性膽道狹窄，需要再次手術(shù)治療［5］。因此，降低術(shù)后增生性膽管炎的發(fā)生率和隨后的纖維化是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是一種天然多酚類黃酮，在不同的組織和器官中均表現(xiàn)出抗纖維化作用［6］。Res參與巨噬細(xì)胞的活化，抑制促炎基因的表達(dá)。Res具有激活Sirt1 和抑制炎癥的能力，Sirt1 會(huì)破壞TLR4/NF-kB/STAT 信號(hào)，從而降低巨噬細(xì)胞衍生的促炎因子產(chǎn)生［7］。膽管狹窄可通過(guò)Res洗脫球囊或支架來(lái)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)張［8］，但Res 直接作用于膽道狹窄部位的藥量有限，且膽汁會(huì)降低藥物作用濃度，但如果使用高濃度的Res又會(huì)帶來(lái)副作用。因此，研究能在膽管狹窄部位局部用藥并能持續(xù)緩慢釋放Res的藥物洗脫支架十分重要。

富勒烯（Fullerene，C60）作為一種強(qiáng)大的抗氧化劑，其中空分子結(jié)構(gòu)可負(fù)載藥物，是一種潛在的藥物遞送載體。C60 可通過(guò)抑制肥大細(xì)胞和外周血嗜堿性粒細(xì)胞抑制促炎介質(zhì)的釋放，達(dá)到抗炎作用［9］。

本文運(yùn)用分子自組裝技術(shù)將具有抗炎功能的Res和C60 組裝成納米結(jié)構(gòu)，并選取聚氨酯（Polyurethane，PU）這一力學(xué)強(qiáng)度、生物相容性良好的高分子材料做載體，并將該納米組裝體負(fù)載PU中，研究其用于膽管支架抗炎涂層領(lǐng)域的可能性。

1 材料與方法

1.1 試 劑

主要試劑：Res和C60 購(gòu)于SIGMA公司，異丙醇、間二甲苯、PU、購(gòu)于常熟市楊園化工有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI1640）固體粉末購(gòu)買于Gibco 公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)于四季青公司。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（HUVECs）購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Res/C60 納米組裝體的制備

配制2 mg/mL的Res異丙醇溶液和6 mg/mL C60間二甲苯溶液。Res 溶液與C60 溶液以不同體積比（2∶1，3∶1，5∶1，10∶1）混合，立即將混合液置于超聲儀（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）中，室溫超聲20 min，4 ℃冰箱靜置過(guò)夜，留存待用?；旌先芤河? 000 r/min離心后，取沉淀風(fēng)干后獲得Res/C60 組裝體粉末。

1.2.2 載Res/C60 的PU（PU-Res/C60）涂層制備

稱取3 g PU，溶于20 mL 四氫呋喃，室溫超聲20 min，制成15%的PU 溶液。將不同體積（1，2，3 mL）的選定納米組裝體溶液加入相應(yīng)體積（9，8，7 mL）的15%PU溶液中，渦旋30 min，制成含有納米組裝體溶液體積比10%、20%、30%的載納米組裝體的PU混合溶液。打開自動(dòng)涂膜機(jī)（AFA-II，魅宇儀器），預(yù)熱至70 ℃，將12 mL混合溶液傾倒在無(wú)塵玻璃板一端，用200 nm的金屬滾動(dòng)涂膜器將溶液緩慢滾動(dòng)成20 cm×10 cm薄膜，將玻璃板放置在通風(fēng)櫥風(fēng)干，待溶劑完全揮發(fā)，揭下薄膜涂層待用。

1.3 Res/C60 納米組裝體理化性能表征

（1）不同投料比例的Res/C60 納米組裝體表面形貌和直徑分布。將Res/C60 納米組裝體溶液分別滴在潔凈硅片上，保持表面潔凈，置于通風(fēng)櫥中過(guò)夜讓溶劑揮發(fā)。樣品表面做噴金處理，使用掃描電子顯微鏡（SEM，Sirion 200，F(xiàn)EI）觀察形貌。Nano Measurer 軟件隨機(jī)選擇100 個(gè)組裝體來(lái)計(jì)算組裝體平均直徑分布。

（2）Res、C60 和Res/C60 納米組裝體的表面形貌。將6 mg/mL的C60 間二甲苯溶液與2 mg/mL 的Res異丙醇溶液以體積比1∶3混合；純Res溶液加入相同比例的間二甲苯，純C60 溶液加入相同比例的異丙醇。將上述3 種溶液分別混合，室溫超聲20 min，4 ℃冰箱靜置過(guò)夜。同樣條件下經(jīng)掃SEM 觀察納米組裝體的表面形貌。

（3）拉曼光譜分析。將純Res、C60 和Res/C60組裝體粉末分別用鑷子挑取少量置于干凈的硅片上，用玻璃片壓平，用色散型共聚焦拉曼光譜儀（Senterra R200-L，Bruker Optics）進(jìn)行測(cè)試。

（4）X-射線衍射圖分析。分別取Res、C60 和Res/C60 粉末用多功能X 射線衍射儀（D8 ADVANCE Da Vinci，Bruker）進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試條件為40 kV、40 mA和掃描范圍2θ=3°～50°。

1.4 PU-Res/C60 涂層的機(jī)械性能評(píng)價(jià)

載藥納米組裝體PU涂層的機(jī)械性能通過(guò)拉伸測(cè)試儀（H5K-S，Hounsfield，UK）進(jìn)行測(cè)定。將樣品膜裁成50 mm×10 mm 的平行樣品，兩夾具之間間距為30 mm，以10 mm/min 的速度進(jìn)行拉伸。每個(gè)樣條平行測(cè)試5 次。

1.5 PU-Res/C60 涂層的藥物緩釋實(shí)驗(yàn)

藥物緩釋過(guò)程采用動(dòng)態(tài)透析法進(jìn)行研究，具體過(guò)程為：取PU-Res/C60 涂層20 mg 置于透析袋中（截留相對(duì)分子質(zhì)量為3.5 kD）。將透析袋浸沒(méi)在10 mL PBS（0.2 mol/L，pH 7.4）中，放置在搖床中震蕩（設(shè)定溫度為37°C，速度為120 r/min）。一定時(shí)間間隔后，將透析袋外液體全部移除，重新加入10 mL PBS（0.2 mol/L，pH 7.4）。收集不同時(shí)間點(diǎn)的透析液并離心（5 000 r/min）保管上清，取2 mL上清用2 mL無(wú)水乙醇稀釋，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定305 nm處藥物的特征紫外吸收值。用PBS與無(wú)水乙醇體積比為1∶1為溶劑，測(cè)定一系列已知濃度的Res溶液紫外吸收值，獲得Res標(biāo)準(zhǔn)曲（Y=0.013 03+0.129 63X，R2=0.999 8）。透析液中Res的濃度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。將組裝體溶液離心取上清，通過(guò)測(cè)得上清液中殘留的Res濃度，計(jì)算得組裝體溶液載藥量為8.35%，包封率為20.75%。

1.6 MTT法測(cè)定細(xì)胞活性

選用HUVECs 進(jìn)行Res/C60 納米組裝體的MTT（methyl-thiotetrazole）法細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。96 孔板中鋪入1 ×104個(gè)細(xì)胞/孔，用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基在含5%CO2和37℃培養(yǎng)12 h。加入Res、C60和組裝體藥物保持其終濃度為10 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按MTT 試劑盒進(jìn)行后續(xù)操作，用酶標(biāo)儀（Multiskan MK3；Thermo Labsystems）在492 nm 下測(cè)量吸光度。取6 個(gè)平行樣品的平均值。

1.7 白藜蘆醇清除DPPH自由基能力的評(píng)價(jià)

取0.1 mL 不同濃度（10，20，30，40，50，80，100 μg/mL）梯度的Res、C60 和Res/C60 納米組裝體溶液分別同1.0 mL 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）乙醇溶液混勻，DPPH 乙醇溶液為空白樣液，于37 ℃反應(yīng)60 min 后在波長(zhǎng)517 nm比色，DPPH 自由基清除率D采用如下公式計(jì)算。

1.8 Res/C60 納米組裝體的抗炎效果評(píng)價(jià)

（1）原代樹突狀細(xì)胞的提取。選取6～8 周齡的C57BL/6 小鼠，頸椎脫臼處死，用注射器反復(fù)吸取無(wú)菌的PBS緩沖液沖洗出骨髓腔中細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min后，取細(xì)胞沉淀，接種于培養(yǎng)皿中，加入終濃度為100 ng/mL 脂多糖（LPS）刺激骨髓造血細(xì)胞成熟，培養(yǎng)的第3 天半量換液，第5 天全量換液，第7 天得成熟的樹突狀細(xì)胞。

（2）Res/C60 納米組裝體對(duì)炎癥因子抑制效果評(píng)價(jià)。將樹突狀細(xì)胞以1 ×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于24 孔板中，培養(yǎng)12 h 待細(xì)胞完全貼壁后，設(shè)定實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照（培養(yǎng)基）、LPS 陽(yáng)性對(duì)照和Res/C60 納米組裝體，陽(yáng)性組和組裝體組分別加入50 μL LPS 溶液，保持其終濃度為100 ng/mL，組裝體組加入50 μL組裝體原液，其余組用相同體積培養(yǎng)基補(bǔ)齊，培養(yǎng)12 h后通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中白細(xì)胞介素1（IL-1），白細(xì)胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的mRNA的表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)納米組裝體的抗炎效果。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)P ＜0.05。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

以上所有實(shí)驗(yàn)都至少做3 次平行，通過(guò)使用單向方差分析比較數(shù)據(jù)獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P ＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 Res、C60 和不同比例納米組裝體的表面形貌及直徑分布

觀察Res、C60 和Res/C60 納米組裝體的表面形態(tài)。純Res呈花瓣樣片狀，純C60 呈細(xì)長(zhǎng)的棒狀，截面為規(guī)整的六邊形，兩者通過(guò)分子自組裝技術(shù)組裝后，為短棒狀，且棱柱的棱角更圓潤(rùn)。

Res溶液與C60 溶液以體積比3∶1混合后得到的組裝體（Res/C60-3∶1），直徑分布在250～450 nm，標(biāo)準(zhǔn)差值最小，說(shuō)明這種比例下的組裝體尺寸分布均勻，為最佳的Res/C60 組裝體的投料比，文中提到Res/C60 組裝體均采用此種制備條件。

圖1 Res（a）和C60（b）和組裝體（c）Res/C60-2∶1，（d）Res/C60-3∶1，（e）Res/C60-5∶1，（f）Res/C60-10∶1的表面形貌和直徑分布

2.2 拉曼光譜及X-射線衍射圖

拉曼光譜反映分子的振動(dòng)頻率信息，可用于分析物質(zhì)的組分和結(jié)構(gòu)。圖2（a）拉曼光譜圖譜中有較強(qiáng)的C60 信號(hào)峰，同樣可以說(shuō)明組裝體中存在C60，組裝體中新生成的峰可能由于兩者組裝形成。

圖2（b）X-射線衍射圖譜顯示，純Res 高度結(jié)晶，并在2θ 的范圍觀察到以16.31°、19.14°、22.39°、23.56°、25.16°、28.26°的尖銳的衍射峰，說(shuō)明了Res是晶體性質(zhì)。此外，在Res/C60 的組裝體上也出現(xiàn)了部分Res和C60 疊加的特征峰。說(shuō)明Res與C60 組裝成功，且大部分是包括在C60 分子內(nèi)部，因此未顯示出強(qiáng)烈特征性的尖峰。

2.3 PU-Res/C60 涂層表面形貌分析

圖2 Res、C60和Res/C60納米組裝體的拉曼光譜圖和X-射線衍射圖譜

圖3 （a）裸支架、覆膜支架和擴(kuò)張后的覆膜支架，（b）覆膜支架SEM圖，（c）、（d）分別為裸支架SEM圖和EDS能譜，（e）、（f）分別為覆膜支架的SEM圖和EDS能譜圖

從圖3（a）、（b）可觀察出，該覆膜彈性良好，擴(kuò)張后有足夠的柔韌性和強(qiáng)度來(lái)支持臨床使用。比較圖3（c）～（f）可知，覆膜的金屬支架對(duì)應(yīng)的能譜圖中（c）、（d）含量升高，驗(yàn)證了PU-Res/C60 涂層的成功涂覆。

2.4 PU-Res/C60 涂層薄膜的力學(xué)性能評(píng)價(jià)

載藥納米涂層薄膜的機(jī)械性能是其在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域應(yīng)用的重要因素。圖4（a）中所有樣品均呈現(xiàn)較好的彈性，隨著載藥量的增加，PU-Res/C60 涂層薄膜的最大斷裂強(qiáng)度逐漸增加。如圖4（b）所示，PURes/C60 涂層薄膜的彈性模量較純PU膜大，且隨著載藥量的增加與增大的趨勢(shì)。機(jī)械性能的結(jié)果表明，在PU中載入Res/C60 納米組裝體后形成的涂層薄膜，彈模量增加，彈性稍有降低，但總體滿足其應(yīng)用需求。

圖4 載有不同藥量的納米組裝體涂層薄膜的機(jī)械性能

2.5 PU-Res/C60 涂層薄膜的藥物緩釋實(shí)驗(yàn)和Res/C60 納米組裝體的自由基清除能力

從圖5（a）可看出，PU-Res/C60-10%納涂層在30天后釋放出約63%的Res藥物，相比較，PU-Res/C60-20%和PU-Res/C60-30%納米組裝體涂層僅釋放出約45%和39%，比PU-Res/C60-10%納米組裝體涂層藥物釋放得更加緩慢，能夠持續(xù)發(fā)揮藥效。

通常，聚合物載藥體系在藥物緩釋初始階段易形成藥物突釋現(xiàn)象，隨后藥物以相對(duì)穩(wěn)定的緩釋速度持續(xù)釋放［10］。PU-Res/C60 涂層在第1 天的藥物緩釋實(shí)驗(yàn)中藥物累積釋放量最高達(dá)20%左右，在30 天的長(zhǎng)周期內(nèi)PU-Res/C60-10%涂層能夠持續(xù)累積釋放60%左右的藥量。由于白藜蘆醇不溶于水，故其在血液中的半衰期較短，生物利用度低，不能長(zhǎng)時(shí)間對(duì)免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗炎作用［11］，所以需要設(shè)計(jì)Res 藥物緩釋系統(tǒng)，達(dá)到藥物持續(xù)釋放和在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)發(fā)揮抗炎效果。本研究設(shè)計(jì)的PU-Res/C60 納米組裝體涂層，可以通過(guò)添加不用含量的Res/C60 納米組裝體來(lái)實(shí)現(xiàn)不同載藥量的需求，Res 與C60 形成的自組裝結(jié)構(gòu)，再與PU形成涂層，兩者都有助于控制其藥物釋放速度，使其在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)可達(dá)到藥物持續(xù)釋放的目的。

羥自由基作用于體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物分子，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷，易引發(fā)炎癥反應(yīng)，羥自由基清除能力是樣品抗氧化能力的重要指標(biāo)。據(jù)圖5（b）可知，Res、C60 和Res/C60 納米組裝體這3 種物質(zhì)的羥自由基清除能力隨濃度增大逐漸成上升趨勢(shì)。組裝體濃度達(dá)100 μg/mL時(shí)，有50%以上的自由基清除率。

圖5 （a）PU-Res/C60 涂層在PBS 緩沖液（pH 7.4）中的體外藥物釋放曲線；（b）Res、C60和Res/C60納米組裝體的自由基清除能力

2.6 Res、C60 和Res/C60 納米組裝體對(duì)體外細(xì)胞存活率的影響及其抗炎效果評(píng)估

如圖6（a）所示，各實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)48 h 后，HUVECs存活率均在90%以上，說(shuō)明Res、C60 和Res/C60 納米組裝對(duì)正常細(xì)胞毒性較低，有較好的生物相容性。

通過(guò)對(duì)與組裝體共培養(yǎng)12 h 后的炎癥因子的表達(dá)水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)LPS 炎癥因子出現(xiàn)明顯下降，如圖6（b）所示，IL-1，IL-6，TNF-α 3 個(gè)代表性的炎癥因子，在LPS誘導(dǎo)下表達(dá)量顯著上升，在持續(xù)的Res釋放條件下，3 種炎癥因子的mRNA 表達(dá)水平受到明顯抑制。

圖6 MTT法測(cè)定Res/C60 納米組裝體48 h 后HUVECs 的存活率；Res/C60納米組裝體孵育12 h后各炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

有研究發(fā)現(xiàn)Res可以減少巨噬細(xì)胞中IL-1 和IL-6的表達(dá)［12］，而IL-1 和IL-6 表達(dá)量增加說(shuō)明細(xì)胞處在促炎狀態(tài)［13］。在慢性膽道梗阻所致大鼠肝損傷動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中［14］，Res 具有顯著性保護(hù)作用，可抑制導(dǎo)管增生和淋巴細(xì)胞炎癥，能很好抑制組織中慢性疾病有關(guān)的低度炎癥狀態(tài)［15］。同時(shí)，Res 可用作膽道梗阻的保護(hù)劑，治療膽管結(jié)扎后的肝功能受損，減少凋亡細(xì)胞數(shù)量［16］。本實(shí)驗(yàn)中Res 表現(xiàn)出與上文一致的抗炎效果，說(shuō)明納米組裝體對(duì)炎癥因子的釋放有明顯的抑制作用。

3 結(jié)語(yǔ)

本文基于分子自組裝技術(shù)得到Res/C60 納米組裝體，在此基礎(chǔ)上研究了該組裝體的理化性能與其應(yīng)用于藥物洗脫支架的可能性。更進(jìn)一步運(yùn)用PU作為組裝體載體，制備得到PU-Res/C60 涂層，驗(yàn)證了其在膽管支架抗炎涂層領(lǐng)域的應(yīng)用。Res/C60 納米組裝體具有良好的藥物緩釋性能、低毒性和抗炎功能，且在膽管支架抗炎涂層領(lǐng)域有一定的應(yīng)用前景，未來(lái)有希望用于臨床改善膽管炎性狹窄。