蛋白質翻譯后修飾的質譜鑒定方法和在精準醫學研究中的應用

周怡孜 姜文國

濱州醫學院藥學院 山東 煙臺 264003

蛋白質翻譯后修飾(Protein post-translational modification，PTM)通過在一個或多個氨基酸殘基上添加化學基團來改變蛋白質的生化特性。因為具有生物學意義的PTM通常在低豐度下以低化學計量比發生，所以在細胞、組織或生物體中完全識別PTM并從這些識別的PTM中獲得有意義的解釋和生物學意義非常困難。目前，唯一適合大規模識別PTM的方法是基于質譜的蛋白質組學[1]。基于質譜法(Mass Spectrometry，MS)的蛋白質組學方法在定量分析各種PTM方面具有獨特優勢，為了更好探索各種生物系統中的不同PTM，研究者越來越重視對蛋白質組學方法的研究[2]。

1 PTM

PTM是蛋白質功能調控的重要方式，PTM可改變蛋白質的穩定性、活性或細胞定位。常見的修飾類型多見于泛素化、甲基化、磷酸化、乙酰化、類泛素化(small ubiquitin-related modifier, SUMO)、糖基化等[3]。PTM可引起蛋白質特性和功能的改變，且在細胞過程中起著重要作用。蛋白質可以被不同程度地修飾，蛋白質不同類型的修飾和修飾位點改變會使蛋白質功能發生不同的改變，從而在細胞中起到不同的作用[4]。任何蛋白質組學研究都需要最大限度地獲取樣本，所以需要從前期樣品制備到后期定量的高度精準。傳統的PTM研究使用的主要是放射性標記技術或者基于特異性抗體的免疫檢測技術，這些技術在研究單一位點翻譯后修飾介導的細胞信號轉導過程方面發揮著非常關鍵的作用。但是需要注意的是，這些技術不容易實現蛋白質翻譯后修飾的大規模檢測，因為其對操作的要求很高且基于這些技術下的特異性抗體制備的周期較長。由于上述方法存在操作要求高、特異性抗體制備周期長等缺點，很難實現PTM的大規模檢測，因此需要具有高度重復性和穩定性的分析技術補充上述方法。近年來，隨著MS的迅速發展，其在蛋白質分析領域得到了廣泛應用，以高效、靈敏、準確、穩定、便捷等特性，成為蛋白質組學應用的首要選擇。

2 MS概述

MS是檢測蛋白質組學和代謝組學細微變化的高效平臺，它可以分析和鑒定復雜混合物中的數千種蛋白質。MS的核心部分為質譜儀。質譜儀由三部分組成：離子源，質量分析器和檢測器，質譜儀能在不使用任何抗體的情況下同時鑒定和定量多種蛋白質，如測定蛋白質的分子量、氨基酸序列、多肽或二硫鍵的數量及位置等[5]。質譜儀可以用來測量蛋白質的分子量[6]，首先通過電離源將蛋白質分子轉化為離子，在加速電場的作用下，這些離子形成離子束被輸送到質量分析器中，通過質量分析器的電磁場作用，促使這些離子聚焦形成質譜圖，從而實現確定蛋白質分子質量的目的。MS可用于定性分析，也可用被檢化合物的穩定性同位素異構物作為內標進行定量分析。

3 MS在PTM蛋白質組學中的應用

隨著質譜儀分辨率的提升，MS被廣泛應用于檢測蛋白質、藥物殘余[7]、代謝類(脂蛋白，脂肪[8])、類固醇、臨床腫瘤[9]、新生兒篩查等領域。目前典型的蛋白質組學分析流程為，首先蛋白質被蛋白酶消化，消化后產生的肽段經過質譜分析，最后根據蛋白質數據庫計算搜索程序進行肽段序列比對[10]。在蛋白質組學分析中輔以特殊的生物信息學分析方法、特殊的酶解手段以及有針對性的蛋白質富集方法可以實現不同PTM的高通量檢測。

3.1 泛素化修飾 泛素化已被人們公認是蛋白酶體降解蛋白質的特異性標記[4]，對于調節細胞蛋白質穩態起著不可或缺的作用。泛素含有76個氨基酸的多肽序，一個或多個該多肽序列可以通過其C末端的兩個甘氨酸殘基選擇性地修飾到多個底物蛋白質的賴氨酸位點上。為了檢測泛素修飾的蛋白質組、利用能夠識別含有異戊肽和胰蛋白酶消化的雙甘氨酸的非克隆抗體，Woong Kim[11]等學者在5 000個蛋白質中鑒定了19 000個雙甘氨酸修飾賴氨酸殘基。Namrata D Udeshi[12]等學者發明了識別和消化具有泛素化賴氨酸側鏈的蛋白質的抗體，該抗體的生產和可用性顯著提高了檢測內源泛素化位點的能力，可從細胞系或組織樣品中檢測數萬個不同的泛素化位點。通過反相色譜在進行離線分級分離，通過化學交聯，將K-GG特異的抗體固定到珠子上，使用這些抗體的泛素化肽制備樣品，并通過MS對富集樣品進行蛋白質組學分析，在細胞培養標記中用氨基酸進行穩定的同位素標記來實現相對定量。胰蛋白酶酶解產生的泛素化多肽具有殘留兩個甘氨酸殘基的特征，而這一點讓其能夠在鑒定泛素化位點上發揮著關鍵作用，當前流行的抗體富集法正是基于這一原理在泛素化位點的鑒定上得到了廣泛使用[13]。

3.2 類泛素化修飾類 類泛素化修飾是蛋白質的翻譯后修飾之一，負責調節許多細胞過程，例如DNA復制、修復、轉錄、信號轉導和核轉運。在SUMO化過程中，SUMO蛋白通過酶共價連接到目標蛋白中賴氨酸的ε-氨基上，這需要E1、E2和E3酶的協同作用。類泛素化修飾的一個重要特征是具有可逆性，其中涉及SUMO特異性蛋白酶(Sentrin/SUMO-specific proteases，SENPs)，SENPs利用其異肽酶活性催化SUMO蛋白的去結合。這些酶通過水解酶活性參與SUMO蛋白成熟的反應，這涉及去除SUMO非活性形式C末端的短片段并暴露兩個甘氨酸殘基。SENP對于維持正常細胞生理所需的SUMO化和去SUMO化之間的動態平衡很重要[14]。泛素和SUMO可以通過競爭占據蛋白質組中的相似殘基來相互拮抗。這些修飾之間的相互作用控制著重要的生物學過程。現在大規模鑒定SUMO多肽是非常困難的，這是因為這種修飾具有低豐度和動態的性質，以及相應多肽的分支結構使得使用傳統鑒定方式對其進行鑒定非常復雜。

由于類泛素化修飾劑與多種蛋白質共價結合于組蛋白的賴氨酸殘基上，Hendriks IA[15]等學者，采用特殊的酶α-裂解型蛋白酶樣本，聯合質譜技術檢測SUMO修飾，方法新穎，利用率高，但處理樣品過程復雜，造價成本較高。本實驗室開發了一種新方法，可以識別同時被SUMO和泛素化修飾的蛋白質[16]。該模型利用SUMO1點突變，將小鼠SUMO1基因第95位點突變，使MS可識別出GG修飾位點。該方法的優勢在于可以方便的采用普通胰酶消化同時檢測體內各種組織的泛素化和SUMO化位點。利用MS分析各組織中蛋白質相關修飾這一方法克服了特殊α-裂解型蛋白酶的缺點，為SUMO化蛋白的鑒定提供了簡便可行的途徑。

3.3 乙酰化修飾 蛋白質乙酰化修飾是蛋白質的可逆翻譯后修飾，主要發生在蛋白質賴氨酸位點上，能夠調控關鍵功能性蛋白質，比如組蛋白、轉錄因子等，使其在調節基因表達中發揮重要作用。特異性抗體和先進的質譜儀器的發展推動了大規模乙酰化位點的鑒定。蛋白質組學調查，Kim[17]等人從HeLa細胞和小鼠肝線粒體蛋白中鑒定出195個蛋白中的388個乙酰化位點。該團隊應用特異性乙酰化蛋白的抗體，首次實現對蛋白質乙酰化位點的系統分析。其后有人使用了相同抗體結合先進的軌道阱質譜儀(Orbitrap)對賴氨酸乙酰化細胞作了全面分析。Kumar團隊[18]使用高分辨率質譜法鑒定了1 750種蛋白質上的3 600個賴氨酸乙酰化位點，并定量了乙酰化反應的變化。以上研究充分說明了特異性抗體對低豐度修飾多肽富集的高效率和先進質譜技術對大規模蛋白質組學分析的重要性。

3.4 糖基化 糖基化是人類蛋白質組中最普遍的蛋白質修飾(約占蛋白質修飾的50%)[19]。糖基化是在酶的控制下，蛋白質或脂質附加上糖類的過程。質膜、內質網和細胞外環境中的大部分蛋白質都是糖基化的。糖基化是結構上最復雜的PTM，因此，這一過程的機制是高度有序的，其程度和復雜性與進化水平密切相關[20]。不同類型的糖基化已經很好的區分其表征、功能及結構，包括N-連接糖基化、O-連接糖基化、C-甘露糖基化、葡聚糖化等[21-22]。其中，N-連接糖基化和O-連接糖基化研究最為廣泛。O-糖基化主要發生在絲氨酸和蘇氨酸側鏈上，有時也可以發生在氧化形式的賴氨酸和脯氨酸殘基上[23]。糖基化在諸如細胞粘附、受體激活、內吞作用、細胞免疫反應等細胞功能方面發揮著非常重要的作用。

3.4.1 N-糖基化 N-糖基化凝集素親和富集是糖蛋白或糖肽富集的有效策略。不同類型的凝集素固定在固體載體上，如瓊脂糖或磁珠，根據其糖鏈結構用于富集糖蛋白或糖肽。使用具有廣泛特異性的凝集素可以顯著提高不同糖肽的富集效率[24]。有團隊開發了可直接用于LC-MS/MS系統的高性能凝集素親和色譜柱和微柱[25]。Martin[26]等研究者開發了當時最有效的N-連接糖肽富集技術，包括連接到多肽鏈上的各種N-連接的多糖以及對寡糖的非還原端有不同結合特異性的幾種凝集素等。糖蛋白用高碘酸鈉氧化，在碳水化合物中生成醛，然后與樹脂上固定的酰肼基團反應，形成肼鍵。去除非糖化肽后，用N-糖苷酶裂解將N-糖肽選擇性地從樹脂中釋放出來，用于分析。2007年，另一個研究小組[27]對這種方法進行了修改，捕獲糖肽而不是糖蛋白，使得樣本損耗最小和提高了靈敏度。基于上述酰肼化學富集方法，Wollscheid等[28]學者開發了一種細胞表面捕獲技術，用于在細胞裂解前標記和富集暴露的N-糖蛋白組。

3.4.2 O-糖基化 O-糖基化-抗體的開發及應用，充分提高了蛋白質O-GlcNAc糖基化的PTM檢測效率[29]。抗體可在不純化蛋白質的前提下完成對于蛋白質O-GlcNAc糖基化的PTM檢測，而且該檢測方法具有較高特異性[30]。糖肽特異性單克隆抗體也開始應用[31]。在這種方法中，O-GlcN酰化肽首先用疊氮半乳糖(GalNAz)進行酶標記，然后通過CuAAC將GalNAz中的自由疊氮基團與可光解生物素探針(PC-PEG-生物素炔基)中的炔基偶聯，再使用親和素親和層析富集生物素化的多肽，最后通過光化學裂解釋放。

4 MS在精準醫學及個體化治療的應用

癌癥的發病機制非常復雜，通常由基因突變驅動，這些基因突變導致控制增殖和與生長因子有關的信號通路被激活。在這些途徑中抑制單個信號節點可導致重新連接至替代途徑，從而誘導產生耐藥性，并且個體之間存在著差異。通過質譜檢測，分析這些差異基因，生成個性化的信號網絡，基因表達譜和細胞表型的視圖，并結合數學模型以查找數據之間的關系[32]，可發現基因、蛋白及具體肽段的變化從而進行精準化治療。PTM調控的改變也影響癌癥發生發展的重要調節過程。例如受體酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase，RTK)的突變可以導致它們調節的細胞過程被激活。現實中許多酪氨酸激酶都是癌基因，其存活或分化機制的功能失調最終會導致惡變。由于這種激活并不總是由基因突變直接引起的，所以對某些腫瘤中活躍的激酶進行鑒定必不可少。Rikova等[33]用免疫沉淀和質譜鑒定了41個肺癌細胞系和150個腫瘤中的激酶磷酸化情況。由此產生的磷酸化酪氨酸信號被用來對樣本進行分類，并識別在肺癌中激活的幾種新的激酶，包括新的ALK和ROS融合蛋白。另一種方法針對磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑的磷酸化底物進行了選擇性肽免疫沉淀實驗[34]。通過檢測PI3K-AKT通路下游的磷酸化位點，可以檢測到通過PTEN功能的喪失或者PI3K催化亞基的激活突變而產生PI3K-AKT通路的激活。這種新方法不需要對通路中的多個基因進行測序，新方法發現的磷酸化蛋白生物標志物可以用來識別PI3K-AKT通路的激活，還可以預測蛋白激酶B(AKT)、3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)、PI3K、哺乳動物靶標或雷帕霉素(mTOR)等藥物抑制劑的療效，這些都顯示出個性化治療的潛力。

5 結論與展望

質譜技術為科研及臨床提供了很多有實用價值的數據，成功解決了許多在此之前難以解決的問題。它不但能夠定量檢測蛋白質表達量的差異，還能結合蛋白富集、生物信息學分析等手段檢測蛋白質PTM的動態變化，另外它還能結合基因組學、轉錄組學、代謝組學等多組學的檢測手段發現不同類型PTM信號通路間的串話(crosstalk)，從而在精準醫學以及個體化治療方面發揮更重要的作用。