乳腺原發癌和淋巴結轉移癌中ALDH1A1和TGF-β1的表達及預后價值

宋婷婷 張會芳 韓玉貞

濱州醫學院附屬醫院病理科 山東 濱州 256603

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，非特殊型浸潤性癌是最常見的組織學類型。對于淋巴結轉移的乳腺癌，盡管其術后行內分泌治療、分子靶向治療和放化療等綜合治療，但有些預后仍較差。乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenases 1，ALDH1)是乳腺癌干細胞的特異性標志物，其高表達與乳腺癌預后不良有關[1-2]。轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)在上皮間質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)中起誘導作用，乳腺癌EMT的發生使轉化細胞具有乳腺癌干細胞的特性[3]。TGF-β1的表達與乳腺癌的惡性進展及不良預后有關[4]。有關ALDH1和TGF-β1的研究大多集中于乳腺原發癌，然而由于腫瘤基因的變異和腫瘤進展，乳腺轉移癌中ALDH1和TGF-β1的表達與原發癌相比，可能存在差異。本研究擬探討ALDH1A1和TGF-β1在乳腺原發癌和相應淋巴結轉移癌中的表達情況及對判斷預后的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集我院病理科2011年1月至2016年12月間行乳腺癌改良根治術的病例，納入隨訪資料完備的197例伴有淋巴結轉移的非特殊型浸潤性乳腺癌患者作為研究對象。所有患者均為女性，術前均未接受新輔助治療，入選病例隨訪至2020年6月，中位隨訪期為47個月。

1.2 抗體與試劑 ALDH1A1兔抗人單克隆抗體(bs-10162R)、TGF-β1兔抗人單克隆抗體(bs-0103R)及SP免疫化學試劑盒(SP-0023)均購于博奧森公司，DAB顯色試劑盒、免疫組化抗原修復液均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組化染色 10%中性福爾馬林溶液固定的石蠟標本按3 μm連續切片，將載玻片放置64℃烤箱中烘烤1 h，再進行二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，自來水沖洗，PBS緩沖液沖洗，高溫高壓抗原修復，PBS沖洗，3%H2O2孵育，PBS沖洗，滴加正常山羊血清工作液孵育，加入一抗(ALDH1A1濃度為1∶100、TGF-β1濃度為1∶200)后4℃過夜，放置37℃恒溫箱中復溫30 min，PBS沖洗，滴加山羊抗兔二抗孵育30 min，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液孵育30 min，PBS沖洗后DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間并及時終止，蘇木素復染，中性樹膠封片。以PBS緩沖液代替一抗作為空白對照組，以已知陽性片作為陽性對照組。

1.4 結果判定 免疫組化結果判定參照Kawasaki等[5]報道的方法，從著色強度和著色范圍兩方面綜合判定。著色強度評分：無色為0分；淡黃色為1分；黃色為2分；棕褐色為3分。陽性細胞比例評分:<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。兩個結果相加計分，<2分為(-)；2～3分為(+)；4～5分為(++)；6～7分為(+++)。根據實驗結果將0～3分定義為陰性，4～7分定義為陽性。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0進行統計學分析，兩個變量之間的相關性采用Spearman的相關分析法；應用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并用Log-rank檢驗做各組生存率比較；單因素和多因素分析采用Cox比例風險回歸模型。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ALDH1A1和TGF-β1的免疫組化結果 ALDH1A1和TGF-β1均表達于細胞漿，常呈現黃色至棕褐色顆粒(圖1)。

A.ALDH1A1在原發癌中的陽性表達；B.ALDH1A1在淋巴結轉移癌中的陽性表達；C.TGF-β1在原發癌中的陽性表達；D.TGF-β1在淋巴結轉移癌中的陽性表達。

2.2 ALDH1A1和TGF-β1在乳腺原發癌和相應淋巴結轉移癌的表達 ALDH1A1和TGF-β1在原發癌和轉移癌中均陽性和均陰性表達的一致率分別為87.82%(173/197)、86.80%(171/197)，ALDH1A1和TGF-β1在乳腺原發癌和相應淋巴結轉移癌之間均呈正相關(P<0.05)，見表1。

表1 乳腺原發癌與淋巴結轉移癌中ALDH1A1與TGF-β1的表達

2.3 乳腺原發癌及淋巴結轉移癌中ALDH1A1、TGF-β1的表達的生存分析Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，原發癌和淋巴結轉移癌中ALDH1A1和TGF-β1陽性組的生存率均明顯低于陰性組，P<0.05`，見圖2。

A-B.ALDH1A1和TGF-β1不同表達的原發癌患者生存曲線比較；C-D.ALDH1A1和TGF-β1不同表達的淋巴結轉移癌患者生存曲線比較。

2.4 乳腺癌臨床病理特征的Cox比例風險回歸模型分析Cox單因素分析顯示，組織學分級(P<0.05)、腫塊大小(P<0.05)、陽性淋巴結個數(P<0.001)、原發癌和轉移癌中ALDH1A1的表達(P<0.001)和TGF-β1的表達(P<0.01)均是患者預后的危險因素。將統計學分析中有統計學意義的變量引入Cox模型進行多因素分析，結果顯示，陽性淋巴結個數(P<0.01)、原發癌中ALDH1A1的表達(P<0.01)、轉移癌中TGF-β1的表達(P<0.05)均為患者總生存率的獨立危險因素，見表2。

表2 197例乳腺癌患者總生存期相關因素分析

2.5 乳腺原發癌和轉移癌中ALDH1A1和TGF-β1的相關性分析Spearman相關性分析顯示，在原發癌和淋巴結轉移癌中ALDH1A1和TGF-β1表達均呈正相關(P<0.05)，見表3。

表3 乳腺原發癌及淋巴結轉移癌中ALDH1A1與TGF-β1表達的相關性分析

3 討論

2003年，Al-Hajj等[6]首先從乳腺癌細胞中分離出分子表型為CD44+CD24-的細胞群，其在免疫缺陷小鼠體內具有高致瘤性，首次提出了乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells，BCSCs)的概念。2007年，Ginestier等[7]證實約500個ALDH1陽性乳腺癌細胞即可在小鼠體內致瘤，隨后研究發現在免疫缺陷小鼠體內致瘤所需的ALDH1陽性細胞比CD44+CD24-細胞所需的數量少，表明ALDH1能更好地用于乳腺癌干細胞的標記。ALDH1家族有三個亞型，分別為ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH1A3，其中ALDH1A1活性最強，被研究最為廣泛[8]。ALDH1A1基因敲除后可降低乳腺癌的轉移和耐藥[9-10]。乳腺癌中ALDH1的表達與患者不良預后有關[1-2,11]。對食管鱗狀細胞癌[12]、肺腺癌[13]和卵巢癌[14]的研究亦顯示ALDH1的表達與患者預后不良有關。本研究表明在197例乳腺原發癌中，ALDH1A1陽性表達與總生存率有關。原發癌中ALDH1A1為患者預后的獨立危險因素。

TGF-β信號可通過誘導Snail/2、ZEBI/2、ET-1、OCT4和HMGA2等轉錄因子的表達從而促進EMT的發生，研究表明，在腫瘤初期，TGF-β作為腫瘤生長抑制因子抑制原位腫瘤分裂和增殖，促使細胞衰老和凋亡；而在腫瘤晚期，TGF-β則促進腫瘤浸潤和轉移[15]。miR-133b作為腫瘤抑制因子，通過直接靶向抑制轉化生長因子受體(TGF-βR1)和抑制TGF-β/SMAD通路來阻斷TGF-β對EMT的誘導及腫瘤的轉移[16]。TGF-β高表達與乳腺癌不良預后有關[4,17]。本研究結果與以上研究結果一致，乳腺原發癌中TGF-β1的高表達與預后不良有關。

乳腺癌淋巴結轉移是判斷乳腺癌預后的重要指標。在乳腺原發癌和相應淋巴結轉移癌中存在蛋白表達的差異。Zhao等[18]研究表明，乳腺原發癌中雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)的表達與相應淋巴結轉移癌中的表達有一定差異，但具有一致性。Goicoechea等[19]研究表明，乳腺原發癌和淋巴結轉移癌中G蛋白偶聯受體激酶相互作用蛋白(G protein coupled receptor kinase interacting protein 1，GIT1)的表達不一致，存在著異質性。Yoshioka等[20]分析發現ALDH1A1在原發灶和淋巴結轉移灶中表達呈顯著正相關。但有研究表明，乳腺淋巴結轉移癌中ALDH1的表達與患者預后無關[21]。然而，有關ALDH1A1和TGF-β1在乳腺原發癌和相應淋巴結轉移癌中的比較研究，國內外鮮有報道。本研究表明，ALDH1A1和TGF-β1的表達在乳腺原發癌和淋巴結轉移癌中有一定的不一致性，但均具有明顯的相關性，且淋巴結轉移癌中ALDH1A1和TGF-β1的高表達均與預后不良有關。轉移癌中TGF-β1為患者預后的獨立危險因素。

TGF-β1可以通過PI3K/AKT信號通路促進乳腺癌細胞EMT[22]。EMT是腫瘤獲取干細胞特性的途徑[3]。TGF-β通路可調控乳腺腫瘤干細胞ALDH1亞群的表達[23]。本研究表明，不論在原發癌還是在淋巴結轉移癌中ALDH1A1和TGF-β1均呈明顯的正相關。因此，我們推測TGF-β1的高表達伴有ALDH1A1的高表達，可能是TGF-β1通路調節乳腺癌EMT的過程，進而調節ALDH1陽性乳腺癌干細胞的發生發展。