基于16S rDNA高通量測序分析2型糖尿病腹瀉患者腸道菌群的變化

韓翠燕 史 寧

1 濱州醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院 山東 煙臺 264003；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 山東 濱州 256603

糖尿病性腹瀉(diabetic diarrhea, DD)是2型糖尿病常見慢性并發(fā)癥之一，其病情頑固，反復(fù)發(fā)作，遷延難愈，對糖尿病患者的生活質(zhì)量造成了極大的影響[1]。DD發(fā)病原因尚不完全清楚，多數(shù)研究者認(rèn)為其與糖尿病自主神經(jīng)病變引起的胃腸動(dòng)力、胃腸激素及胃腸道微生態(tài)平衡紊亂有關(guān)[2]。其中，腸道菌群與DD的關(guān)系在近些年得到了關(guān)注，但是腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能改變的變化規(guī)律尚不完全清楚。本研究基于16S rDNA高通量測序，通過比較DD患者與健康人群中腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化，探索DD發(fā)病與腸道菌群的聯(lián)系，為預(yù)防和治療DD提供新的思路。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年3月至2019年9月期間在膠州市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科就診，確診為2型糖尿病伴腹瀉患者作為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)為：①符合美國糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)制定的《糖尿病診療指南》(2010年新版)中關(guān)于2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。②患者大便次數(shù)增多(≥3次/天)、排泄量增多、呈褐色水樣蛋花狀，便質(zhì)稀、發(fā)作超過2周。③排除細(xì)菌性和其他腸道疾病引起的腹瀉。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①合并其他胃腸道疾病，如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等。②合并其他嚴(yán)重疾病如癌癥、肝腎功能不全、心血管系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病等。③3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素、固醇類藥物、中草藥、益生元和腸道微生態(tài)制劑等影響腸道菌群的藥物。同時(shí)選取進(jìn)行體檢的兩個(gè)月內(nèi)未使用抗生素和腸道微生態(tài)制劑的健康人群作為對照組。所有參與本研究的患者在研究前對本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康募斑^程均有充分的了解，患者表示自愿參與本次研究,并簽署知情同意書,符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求并經(jīng)倫理委員會(huì)審批通過。至2019年9月研究結(jié)束，納入符合標(biāo)準(zhǔn)的2型糖尿病腹瀉患者18例，對照組23例。

1.2 樣本的采集及信息的收集 清晨，于清潔環(huán)境中采集未進(jìn)食患者及健康人群新鮮糞便標(biāo)本，取糞便中段且中心位5g左右的樣本，置于15 mL一次性無菌采便管內(nèi)，迅速冷凍，保存于-80℃超低溫冰箱。同時(shí)收集所有受試者的一般資料，如年齡、性別、現(xiàn)病史、家族史、服用藥物、體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index，BMI)、生活習(xí)慣等臨床資料。

1.3 樣本DNA提取和16S rDNA測序 依據(jù)操作說明書采用Bio-Tek公司的PowerSoil@ DNA Isolation Kit對糞便樣本提取細(xì)菌的全部DNA。使用紫外分光光度計(jì)檢測DNA的濃度和純度。并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的完整性。測序文庫構(gòu)建及Illumina Miseq平臺高通量測序由廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心完成。具體如下：針對16S rDNA的V3區(qū)，選用上游引物338F和下游引物534R進(jìn)行擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為20μL，包括微生物DNA2μL，PCR正向引物1μL，反向引物1μL。然后使用SRBR?GreenrealtimePCR對樣品文庫進(jìn)行qPCR定量。對混合物進(jìn)行質(zhì)量控制，使用Illumina Miseq系統(tǒng)進(jìn)行測序。用下機(jī)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.4 生物信息學(xué)分析與統(tǒng)計(jì) 測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制測序接頭序列、低質(zhì)量序列和低復(fù)雜度序列，利用重疊關(guān)系進(jìn)行序列拼接。使用UPARSE進(jìn)行序列分析，將相似性≥97%的序列歸為相同的操作分類單元(UTOs)，運(yùn)用金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心的生物信息數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行樣本腸道菌群的相關(guān)性分析，分析包括Alpha多樣性，物種差異分析等。運(yùn)用Wilcox秩和檢驗(yàn)對2型糖尿病伴腹瀉患者和健康對照組腸道菌群之間的差異進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 本研究中納入符合標(biāo)準(zhǔn)的2型糖尿病腹瀉患者18例，健康對照組23例。2組中受試者：一般資料中的年齡、性別、BMI相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示基本資料相匹配；2型糖尿病腹瀉組的空腹血糖和糖化血紅蛋白高于健康對照組，P<0.05，見表1。

表1 所有受試者一般資料比較

2.2 菌群多樣性分析 Alpha多樣性可以反映微生物群落的豐度和多樣性，常用的度量標(biāo)準(zhǔn)包括：計(jì)算菌落豐度的指數(shù)，如ACE指數(shù)，Chao1指數(shù)；計(jì)算菌群多樣性的指數(shù)，如Simpson指數(shù)，Shamnon指數(shù)[4]。其中豐度指數(shù)ACE和Chao1數(shù)值越大說明群落的豐富度越高；群落多樣性指數(shù)Shamnon越大，說明群落多樣性越高。而Simpson指數(shù)與其他指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。將2型糖尿病腹瀉患者與健康對照組間進(jìn)行Wilcox秩和檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，與健康對照組相比，患者組的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shamnon指數(shù)降低，P<0.05，而Simpson指數(shù)增高，P<0.05。結(jié)果顯示2型糖尿病腹瀉患者腸道中菌群的豐度和多樣性低于健康對照組，見圖1。

A.ACE指數(shù)；B.Chao1指數(shù)；C.Shamnon指數(shù)；D.Simpson指數(shù)。與健康對照組比較，*P<0.05。

2.3 門(Phylum)水平腸道菌群差異分析 2型糖尿病腹瀉患者和健康對照組中均檢測出11個(gè)門，其中主要包括：厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)，藍(lán)菌門(Cyanobacteria)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、軟壁菌門(Tenericutes)等。2型糖尿病腹瀉患者豐度前5位依次是：厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門、疣微菌門。健康對照組豐度前5位依次是：擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門，放線菌門(圖2)。運(yùn)用Wilcox秩和檢驗(yàn)對兩組樣本進(jìn)行組間物種豐度差異顯著性分析，結(jié)果顯示患者組擬桿菌門占比低于健康組，P<0.05；而厚壁菌門，疣微菌門高于健康組，P<0.05。值得注意的是，厚壁菌門/擬桿菌門比值(Firmicutes/Bacteroidetes)，患者組高于健康組，P<0.05。見圖3。

A.厚壁菌門；B.擬桿菌門；C.疣微菌門；D.厚壁菌門/擬桿菌門比值。與健康對照組比較，*P<0.05，***P<0.001。

A.厚壁菌門；B.擬桿菌門；C.疣微菌門；D.厚壁菌門/擬桿菌門比值。與健康對照組比較，*P<0.05，***P<0.001。

2.4 屬(Genus)水平腸道菌群差異分析 在屬水平的分析中，健康對照組樣本中檢測出254個(gè)屬，而糖尿病性腹瀉患者樣本中僅檢測出了238個(gè)屬，各個(gè)樣本之間差異較大。在屬水平，核心菌群主要包括擬桿菌屬(Bacteroides)、勞特氏菌屬(Blautia)、糞球菌屬(Coprococcus)、梭菌屬(Clostridium)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、羅式菌屬(Roseburia)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、瘤胃球菌屬(Ruminnococcus)等8個(gè)菌屬。選取各組中前5的優(yōu)勢菌組成，分別統(tǒng)計(jì)其占比，如表2所示。對組間物種豐度差異性進(jìn)行分析，其中2型糖尿病腹瀉患者組中糞桿菌屬(Faecalibacterium)低于健康對照組，P<0.05。

表2 健康人群與2型糖尿病伴腹瀉患者優(yōu)勢菌屬分析(前5位)

3 討論

人體的腸道中至少存在著1000多種，數(shù)量高達(dá)10萬億的微生物，這些微生物在腸道中保持著一種動(dòng)態(tài)的平衡，能夠合成維生素、幫助人體從食物中吸收營養(yǎng)、維持腸道免疫系統(tǒng)功能、抵擋有害微生物的侵害，被稱為人體后天獲得的“第二基因組”[5]。糖尿病性腹瀉是2型糖尿病常見慢性并發(fā)癥之一，既往的多項(xiàng)研究表明，其發(fā)病與腸道菌群紊亂與腸道黏膜屏障功能失調(diào)有關(guān)[6-8]，提示腸道菌群結(jié)構(gòu)與豐度的變化在其發(fā)成發(fā)展中扮演著重要的角色。

高通量測序技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的核心技術(shù)之一，它實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對幾百萬 DNA 分子測序的可能性，達(dá)到鑒定微生物的單一基因或全基因組的目的[9]。本研究針對細(xì)菌16SrDNAV3-V5區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行高通量測序，通過對18例2型糖尿病腹瀉患者和23例健康對照人群中糞便中腸道菌群結(jié)構(gòu)及豐度多樣性的比較，發(fā)現(xiàn)兩組人群存在著顯著的差異。Alpha多樣性分析顯示，通過比較兩組人群腸道菌群的ACE指數(shù)，Chao1指數(shù)，Shamnon指數(shù)和Simpson指數(shù)，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病腹瀉患者腸道菌群多樣性降低，與健康人群相比結(jié)構(gòu)失衡，與Su[10]等的研究結(jié)果相似。

菌群結(jié)構(gòu)分析可以揭示腸道菌群種類及其相對豐度。在門水平上，本研究發(fā)現(xiàn)無論2型糖尿病腹瀉患者還是健康對照組患者，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門的豐度都較高，它們所包含的細(xì)菌數(shù)量占腸道細(xì)菌總量的95%以上，但是部分菌群的相對豐度存在顯著差異。以往研究表明，在2型糖尿病早期進(jìn)程中，肥胖和胰島素抵抗已經(jīng)使腸道優(yōu)勢菌群的種類和豐度均發(fā)生了變化[11-12]。如Larsen[13]等納入了18例2型糖尿病患者，采用16S rRNA測序發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腸道中厚壁菌門和擬桿菌門的豐度明顯低于正常人，另外厚壁菌門/擬桿菌門比值對比值與血糖水平呈正相關(guān)。在本研究中，在2型糖尿病腹瀉患者腸道中，厚壁菌門，疣微菌門豐度顯著增高，而擬桿菌門豐度降低，另外厚壁菌門/擬桿菌門比值增高。而以往部分研究結(jié)果顯示，2型糖尿病患者中厚壁菌門豐度降低。我們推測差異的產(chǎn)生原因與樣本來源的地域、年齡、飲食習(xí)慣、生活習(xí)慣等造成的個(gè)體差異有關(guān)，另外以往研究納入2型糖尿病患者而未關(guān)注腹瀉，提示厚壁菌門的豐度與腹瀉的發(fā)生有一定的相關(guān)性。

丁酸鹽產(chǎn)生菌是一類腸道內(nèi)可發(fā)酵產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)的細(xì)菌。丁酸對維持腸上皮細(xì)胞完整性，調(diào)節(jié)腸黏膜免疫和減少氧化損傷起著重要的作用[14]。目前已知的主要產(chǎn)生丁酸的細(xì)菌包括糞桿菌屬(Faecalibacterium)，羅氏菌屬(Roseburia)等。另外在糖尿病與腸道菌群危險(xiǎn)因素相關(guān)性的研究中，勞特氏菌屬(Blautia)和糞桿菌屬(Faecalibacterium)是糖尿病的危險(xiǎn)因素[15]。本研究中，在屬水平上，與健康受試者相比，2型糖尿病腹瀉患者腸道中糞桿菌屬(Faecalibacterium)，羅氏菌屬(Roseburia)的豐度均降低，其中糞桿菌屬(Faecalibacterium)菌屬降低。

綜上所述，2型糖尿病腹瀉患者腸道菌群相比健康人群出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和豐度紊亂，表現(xiàn)為菌群多樣性降低和部分菌群的豐度發(fā)生變化，如產(chǎn)生丁酸的菌屬豐度降低。2型糖尿病腹瀉患者的腸道菌群在在維持腸道穩(wěn)態(tài)和正常代謝，抵御致病菌定植等方面功能減弱。提示通過微生態(tài)制劑調(diào)整腸道微生態(tài)的平衡可能有助于2型糖尿病腹瀉的治療。