VEGF-B對胰島β細(xì)胞胰島素分泌和Ca2+、cAMP、ATP含量的影響

賈景丹 駱 徐 于瀚浦 鄭蘭蕙 劉婉琛 王梓旭 李雅娜

1 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 山東 煙臺 264003；2 濱州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院 山東 煙臺 264003

糖尿病是一類以高血糖為基本臨床特征的代謝性疾病，高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損引起。WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國成年人的糖尿病總患病率從2007年的9.7%上升到2017年的11.2%，其中2型糖尿病患者占我國糖尿病患者總數(shù)的90%以上[1-2]。糖尿病及其并發(fā)癥嚴(yán)重威脅著人類健康，但目前關(guān)于糖尿病發(fā)病及胰島素分泌機(jī)制的研究仍未完全清楚。因此，進(jìn)一步探索胰島素分泌機(jī)制一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

血管內(nèi)皮生長因子B(vascular endothelial growth factor-B，VEGF-B)可以通過降低db/db小鼠體內(nèi)異常的脂質(zhì)蓄積來恢復(fù)胰島素敏感性，從而改善胰島素抵抗。VEGF-B參與脂質(zhì)攝取的過程為調(diào)節(jié)糖尿病、肥胖癥和心血管疾病中病理性脂質(zhì)蓄積的新策略開辟了可能性[3-4]，但目前關(guān)于VEFG-B參與胰島素分泌及胰島素抵抗的具體機(jī)制仍不明確。小鼠胰島素瘤細(xì)胞(MIN6細(xì)胞系)是從小鼠胰島β細(xì)胞瘤或胰島細(xì)胞瘤中分離得到的永久細(xì)胞系，保留了胰島β細(xì)胞特性，可以反映其功能變化，是研究胰島細(xì)胞功能的理想模型[5]。本研究旨在干預(yù)MIN6細(xì)胞中VEGF-B的表達(dá)，觀察胰島素分泌及鈣離子(Ca2+)、3′,5′-環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、三磷酸腺苷(ATP)含量的變化，分析VEGF-B在胰島β細(xì)胞胰島素分泌過程中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 小鼠胰島素瘤MIN6細(xì)胞購于武漢菲恩生物技術(shù)有限公司；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒購于bimake公司；VEGF-B抗體及相應(yīng)二抗購于Affinity公司；VEGF-B蛋白購于PeproTech公司；jet PRIME轉(zhuǎn)染試劑盒購于Polyplus公司；蛋白酶抑制劑PMSF、組織細(xì)胞高效裂解液、loading buffer、ATP檢測試劑盒購于Solarbio公司；ELISA試劑盒購于mlbio公司。主要儀器有超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，酶標(biāo)儀，離心機(jī)，光學(xué)顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MIN6細(xì)胞采用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Hyclone)培養(yǎng)，其中加入10%胎牛血清(FBS，gibco)、1%青霉素和鏈霉素，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。平均每兩天進(jìn)行1次細(xì)胞換液，待細(xì)胞長至約80%的密度時(shí)進(jìn)行胰酶消化，然后以1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。根據(jù)表1，選定VEGF-B蛋白刺激濃度為50 ng/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)以未經(jīng)VEGF-B干預(yù)的MIN6細(xì)胞作為對照組。

表1 VEGF-B對MIN6增殖的影響

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 將生長良好的MIN6細(xì)胞均勻接種于12孔板中，孵育12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，并使用jet PRIME試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將jet buffer、jet regent和500 nM siRNA(見表2)混合靜置15 min后，緩慢滴加入每孔培養(yǎng)基內(nèi)，繼續(xù)孵育48 h后，進(jìn)行Westernblot分析。以未加入siRNA的VEGF-B處理后的MIN6細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染后的對照組。

表2 siRNA 序列

1.2.3 Western Blot檢測VEGF-B蛋白表達(dá)水平 使用siRNA抑制VEGF-B 48 h后，收集細(xì)胞1 200 rpm離心5 min后吸去上清液，加入含有1%蛋白酶抑制劑的組織細(xì)胞高效裂解液，超聲波破碎后置冰上裂解30 min。4℃離心機(jī)(Thermo Fisher)12 000 rpm離心20 min后收集上清液，加入loading buffer震蕩混勻后于煮樣器(TU-100C)中95℃煮10 min，冷卻后取60 μg蛋白質(zhì)溶解在10%SDS-PAGE凝膠中，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon)。5%脫脂牛奶封閉后，VEGF-B一抗4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗室溫孵育2 h后，通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(Tanon-5200)可視化蛋白質(zhì)表達(dá)，光密度值(OD)測定法定量檢測。

1.2.4 酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒檢測 對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后收集上清液，2 000～3 000 rpm離心20 min后，Ins試劑盒測定胰島素的分泌量；通過反復(fù)凍融細(xì)胞，2 000～3 000 rpm離心20 min，收集上清，Ca2+和cAMP試劑盒分別測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+和cAMP含量。酶標(biāo)儀450 nm處測量光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品測定值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，由得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算各組樣品的胰島素、Ca2+和cAMP水平。

1.2.5 ATP含量檢測 試劑盒收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，取500萬細(xì)胞加入1 mL提取液，超聲波破碎1 min，10 000 rpm 4 ℃離心10 min后，取上清液至另一EP管中，加入 500 μL 的氯仿充分震蕩混勻，10 000 rpm 4℃離心 3 min，取上清，按照試劑盒測定步驟檢測各組中ATP含量后按照細(xì)胞密度進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-B抑制MIN6細(xì)胞的胰島素分泌 在5.5 mM和25 mM葡萄糖培養(yǎng)條件下，50 ng/mL VEGF-B刺激MIN6細(xì)胞24 h后，其胰島素分泌量比2 h時(shí)減低，P<0.01(圖1A、B)。和對照組相比，葡萄糖培養(yǎng)24 h后VEGF-B刺激組的胰島素分泌量也減低，P<0.01(圖1A、B)。如圖1C、D，siRNA轉(zhuǎn)染抑制VEGF-B后的蛋白表達(dá)水平顯示，siRNA-1序列抑制效率最高，后續(xù)均用siRNA-1序列(后簡稱為siRNA)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。抑制MIN6細(xì)胞的VEGF-B后，在5.5 mM葡萄糖培養(yǎng)條件下，和對照組相比，抑制2h后MIN6細(xì)胞胰島素分泌量增加，P<0.05(圖1E)；在25 mM葡萄糖培養(yǎng)條件下，和對照組相比，抑制24h后MIN6細(xì)胞胰島素分泌量增加，P<0.01(圖1F)。

A、B為VEGF-B蛋白刺激MIN6細(xì)胞對胰島素分泌的影響(n=6)；C、D為siRNA抑制VEGF-B后的蛋白表達(dá)水平(n=3)；E、F為siRNA抑制VEGF-B后對MIN6細(xì)胞胰島素分泌的影響(n=6)。和相應(yīng)的對照組比較，

2.2 VEGF-B抑制MIN6細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量 在5.5 mM和25 mM葡萄糖培養(yǎng)條件下，50 ng/mL VEGF-B刺激MIN6細(xì)胞24 h后，和對照組相比，細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量減少，P<0.05(圖2A、2B)。抑制VEGF-B后，在5.5 mM和25 mM葡萄糖培養(yǎng)條件下，和對照組相比，抑制VEGF-B 后MIN6細(xì)胞的Ca2+含量增加，P<0.05(圖2C、2D)。

A、B為VEGF-B蛋白刺激MIN6細(xì)胞對Ca2+含量的影響(n=6)；C、D為siRNA抑制VEGF-B對MIN6細(xì)胞 Ca2+含量的影響(n=6)。

2.3 VEGF-B抑制MIN6細(xì)胞內(nèi)cAMP含量 在5.5 mM葡萄糖培養(yǎng)條件下，50 ng/mL VEGF-B在刺激MIN6細(xì)胞24 h后，和對照組相比，MIN6細(xì)胞內(nèi)cAMP含量減少，P<0.01(圖3A)。在25 mM葡萄糖培養(yǎng)條件下，50 ng/mL VEGF-B 刺激MIN6細(xì)胞后，2 h和24 h時(shí)細(xì)胞cAMP含量均低于對照組，P<0.01(圖3B)。在5.5 mM葡萄糖培養(yǎng)條件下，抑制VEGF-B 后，2 h和24 h后MIN6細(xì)胞cAMP含量均高于對照組，P<0.01，且24 h后cAMP含量比2 h時(shí)升高更顯著，P<0.05(圖3C)。

A、B為VEGF-B蛋白刺激MIN6細(xì)胞對cAMP含量的影響(n=6)；C、D為siRNA抑制VEGF-B對MIN6細(xì)胞 cAMP含量的影響(n=6)。

2.4 VEGF-B抑制MIN6細(xì)胞內(nèi)ATP含量 在25 mM葡萄糖培養(yǎng)條件下，50 ng/mL VEGF-B在刺激MIN6細(xì)胞24 h后，和對照組相比，MIN6細(xì)胞內(nèi)ATP含量減少，P<0.05(圖4B)。在25 mM葡萄糖培養(yǎng)條件下，抑制VEGF-B 后，MIN6細(xì)胞24 h的ATP含量高于對照組，P<0.05，且高于2 h的ATP含量，P<0.01(圖4D)。

A、B為VEGF-B蛋白刺激MIN6細(xì)胞對ATP含量的影響(n=6)；C、D為siRNA抑制VEGF-B對MIN6細(xì)胞 ATP含量的影響(n=6)。

3 討論

VEGF-B是VEGFs家族成員中發(fā)現(xiàn)較晚的一個(gè)因子，主要在心肌、骨骼肌、棕色脂肪等代謝活性高的組織中表達(dá)[6-8]。與其他家族成員的作用不同，VEGF-B在生理?xiàng)l件下沒有明顯的促進(jìn)血管生成的作用，但對抑制AngII誘導(dǎo)的心肌肥大，促進(jìn)骨骼肌吸收脂質(zhì)，抑制脂肪酸再酯化以及促進(jìn)甘油三酯隨脂肪酸氧化分解起著一定作用[9-11]。在視網(wǎng)膜中，VEGF-B的缺失或阻斷可導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性，而其抗氧化功能可保護(hù)組織和細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷[12-13]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病、肥胖癥和心血管疾病等病理情況下，VEGF-B缺失表現(xiàn)出調(diào)節(jié)脂質(zhì)蓄積，改善胰島素抵抗，減輕體重和代謝并發(fā)癥的作用[14-16]。VEGF-B除調(diào)控內(nèi)皮脂肪酸(FA)的攝取外[4]，還與VEGF-A共同調(diào)節(jié)脂肪分化和能量代謝的平衡[17]。但Dijkstra等[18]發(fā)現(xiàn)VEGF-B在糖尿病小鼠的脂質(zhì)代謝變化方面并沒有太大作用。對于糖尿病患者體內(nèi)VEGF-B的研究也呈現(xiàn)出不同的觀點(diǎn)。2017年Wu等[19]在糖尿病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者的血漿VEGF-B水平顯著高于正常葡萄糖耐量受試者，表明VEGF-B可能是葡萄糖代謝異常的相關(guān)因素。而Sun等[20]在2型糖尿病患者與健康成人的對比研究中發(fā)現(xiàn)，二者血漿中VEGF-B濃度沒有差異。目前VEGF-B已經(jīng)被預(yù)測為治療2型糖尿病的一種有前途的潛在方式，但關(guān)于VEGF-B與胰島素分泌的研究還比較少。VEGF-B是否參與葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌過程，VEGF-B是否參與調(diào)控胰島素分泌信號通路，這些研究將為VEGF-B參與胰島素分泌與糖尿病發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。

本研究在MIN6細(xì)胞模型中研究VEGF-B對胰島素分泌的影響，為后續(xù)VEGF-B基因敲除小鼠體內(nèi)胰島素分泌的變化提供理論參考。在胰島β細(xì)胞中，葡萄糖是刺激胰島素分泌的重要環(huán)境因素。當(dāng)葡萄糖進(jìn)入胰島β細(xì)胞后，氧化分解釋放能量會(huì)產(chǎn)生大量的ATP，導(dǎo)致細(xì)胞膜中的ATP敏感型鉀離子通道關(guān)閉，進(jìn)而細(xì)胞膜內(nèi)陽離子增多，電位升高激活電壓依賴性的鈣離子通道，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流增加，觸發(fā)胰島素分子向細(xì)胞外釋放。

胰島素分泌及其分泌調(diào)控是維持機(jī)體葡萄糖平衡的重要機(jī)制，而其第二信使Ca2+濃度是影響胰島素分泌的重要因素，胰島β細(xì)胞主要通過質(zhì)膜上的ATP敏感鈣通道和胞內(nèi)鈣庫活動(dòng)改變胞內(nèi)Ca2+濃度，從而調(diào)控胰島β細(xì)胞的胰島素分泌[21-22]。生理?xiàng)l件下，Ca2+濃度增加可直接觸發(fā)胰腺β細(xì)胞分泌胰島素[23]。而葡萄糖除了導(dǎo)致Ca2+改變外，還增加了胰島β細(xì)胞的cAMP含量[24]。高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)中cAMP濃度升高是由Ca2+濃度升高繼發(fā)引起的，即Ca2+濃度的升高會(huì)增加環(huán)狀A(yù)MP的產(chǎn)生[25-26]。另一方面，cAMP還可以增加小鼠胰腺β細(xì)胞胞吐對Ca2+的敏感性[27]。針對不同濃度葡萄糖對胰島素分泌、ATP、Ca2+和cAMP含量的影響不同，因此，本實(shí)驗(yàn)采用在低葡萄糖(5.5 mM)和高葡萄糖(25 mM)兩種培養(yǎng)條件下研究VEGF-B對胰島β細(xì)胞分泌胰島素的影響及其相關(guān)的信號調(diào)控體系。

本研究顯示在5.5 mM和25 mM葡萄糖培養(yǎng)基中，加上VEGF-B后均表現(xiàn)出抑制胰島素分泌的作用。抑制VEGF-B后，MIN6細(xì)胞則表現(xiàn)出胰島素分泌增加的現(xiàn)象，同時(shí)MIN6細(xì)胞內(nèi)Ca2+、cAMP和ATP含量的變化趨勢與胰島素一致。這與Ning等[28]在胰島β細(xì)胞特異性VEGF-B缺陷的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)的胰島β細(xì)胞的VEGF-B特異性缺失可增加胰島素分泌的結(jié)果相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VEGF-B參與MIN6細(xì)胞胰島素分泌，并且VEGF-B是通過改變胞內(nèi)Ca2+濃度和cAMP含量影響胰島素分泌，而不是簡單作用于胰島素及其受體本身。因此VEGF-B與胰島素分泌抑制的相關(guān)性可以為2型糖尿病的預(yù)防及治療提供機(jī)制上的見解，而抑制VEGF-B信號能否成為一種新的有前途的治療方案仍需要進(jìn)一步深入研究。