地塞米松聯(lián)合姜黃素對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的作用

張 琪 田寶成 趙慶沛 盛玉輝 黃菁華 呂青志 李珂珂

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003; 2 即墨區(qū)第二人民醫(yī)院 山東 青島 266214

炎癥可發(fā)生在心血管系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等病理過(guò)程中，炎癥在各類疾病中占據(jù)重要地位。地塞米松(dexamethasone, DEX)為糖皮質(zhì)激素類藥物，具有強(qiáng)有力的抗炎效果和免疫調(diào)節(jié)作用[1]，但長(zhǎng)期高劑量全身用藥會(huì)使患者出現(xiàn)免疫抑制，水、電解質(zhì)代謝紊亂等嚴(yán)重的不良反應(yīng)。DEX作為P-糖蛋白(P-gp)底物，在長(zhǎng)期使用后會(huì)出現(xiàn)多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)現(xiàn)象，MDR是臨床治療腫瘤及慢性炎癥性疾病失敗的主要原因之一[2]，逆轉(zhuǎn)MDR現(xiàn)象是當(dāng)前提高DEX療效的重要策略[3]。姜黃素(curcumin, CUR)是從姜科植物姜黃中提取的一種黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗缺血、抗炎等生物活性，CUR抑制P-gp的活性也得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)[4]。若DEX與CUR聯(lián)合使用能夠產(chǎn)生協(xié)同抗炎作用，則可通過(guò)減少DEX的用量，降低藥物的毒副作用，同時(shí)借助于CUR逆轉(zhuǎn)DEX的MDR作用，進(jìn)一步提高DEX的療效。

本研究選用脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞作為炎癥細(xì)胞模型，以細(xì)胞分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)的量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察DEX與CUR聯(lián)合用藥的抗炎作用，應(yīng)用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法評(píng)價(jià)藥物間的相互作用，篩選出DEX與CUR協(xié)同抗炎的比例。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞對(duì)P-gp特異性底物Rh-123的攝取情況，考察在協(xié)同配伍摩爾比例下CUR逆轉(zhuǎn)DEX的MDR作用。采用低毒、具有優(yōu)良生物降解性和生物相容性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic acid-glycolic acid copolymer, PLGA)作為載體材料[5]，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備DEX/CUR-NPs，考察DEX與CUR兩藥共載納米粒的體外抗炎活性，為炎癥疾病的治療提供新的思路與策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 HERAcell 150 Heraeus CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；TD5G離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；Usb 2.0倒置顯微鏡(青島長(zhǎng)基醫(yī)療器械有限公司)；Spectra Max Mz酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；EPICS XL流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)；XHF-D高速分散器(寧波新芝生物科技有限公司)；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)；JEM-1400透射電子顯微鏡(TEM)(日本電子株式會(huì)社)。

1.1.2 藥品與試劑 醋酸地塞米松(國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司，批號(hào)為XW11778731，純度為98%)；姜黃素(國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司，批號(hào)為GB20150505，分析純)；維拉帕米(Verapamil, VER)(上海阿拉丁生化科技有限公司，批號(hào)為L(zhǎng)1803208，純度為99%)；羅丹明-123(Rhodamine-123, Rh-123)(上海阿拉丁生化科技有限公司，批號(hào)為B1806031，純度為99%)；脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為028M4094V，純度≥99%)；NO檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為062119191122)。

1.1.3 細(xì)胞 小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株，購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞分散于RPMI 1640培養(yǎng)液(含10 %胎牛血清，100 μmol/L青霉素、鏈霉素)中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞覆滿至培養(yǎng)皿的70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 游離藥物細(xì)胞活力檢測(cè) 應(yīng)用MTT法考察DEX與CUR游離藥物單用及合用時(shí)對(duì)RAW264.7細(xì)胞的體外毒性[6]。以每孔5×103個(gè)細(xì)胞密度接種RAW264.7細(xì)胞于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，加入藥物進(jìn)行處理，設(shè)置對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)細(xì)胞重復(fù)孔，給藥1 h后用1 μg/mL LPS進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)[7]，藥物與細(xì)胞共孵育24 h，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.2.2.2 藥物相互作用評(píng)價(jià) 用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法[8]對(duì)兩藥相互作用進(jìn)行分析，該方法適用于藥物單獨(dú)使用及兩藥按照固定比例進(jìn)行混合的情況。按以下公式計(jì)算協(xié)同指數(shù)(CI)值，并判斷兩種藥物的相互作用：CI=D1/Dx,1+D2/Dx,2，其中，D1、D2表示兩藥聯(lián)用產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)兩藥對(duì)應(yīng)的濃度，Dx,1、Dx,2為兩藥單用產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度。當(dāng)CI>1時(shí)，兩藥為拮抗作用；當(dāng)CI=1時(shí)，兩藥為相加作用；當(dāng)CI<1時(shí)，兩藥為協(xié)同作用。

1.2.2.3 DEX與CUR協(xié)同抗炎配伍摩爾比例的篩選 以每孔5×104個(gè)細(xì)胞密度接種RAW264.7細(xì)胞于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，加入藥物處理，設(shè)置DEX濃度為0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L，CUR濃度為0.5、5、7.5、15、20、25、30 μmol/L，聯(lián)合給藥濃度見(jiàn)表1，設(shè)置對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)細(xì)胞重復(fù)孔。藥物處理1 h后，加入1 μg/mL LPS進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)。藥物與細(xì)胞共孵育24 h后收集各組細(xì)胞上清液，應(yīng)用Griess比色法測(cè)定各組上清液中NO的含量[9]。應(yīng)用Calcusyn 2.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，應(yīng)用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法對(duì)兩藥相互作用進(jìn)行分析。

表1 DEX與CUR不同配伍比例聯(lián)合用藥的給藥方案

1.2.2.4 CUR對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞Rh-123外排的影響 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)考察CUR對(duì)P-gp特異性底物Rh-123外排的影響[10]。實(shí)驗(yàn)設(shè)置Rh-123組(陰性對(duì)照組)、Rh-123+VER組(陽(yáng)性對(duì)照組)、Rh-123+DEX單藥(低、中、高劑量)組、Rh-123+DEX+CUR(1∶3、1∶5)組，Rh-123濃度與LPS的活化濃度均為1 μg/mL，實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 DEX/CUR-NPs的制備及其質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.2.3.1 DEX/CUR-NPs的制備及其藥劑學(xué)性質(zhì)表征 采用乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒。按照DEX與CUR配伍摩爾比例為1∶5進(jìn)行投藥，稱取0.6 mg DEX、3 mg CUR至30 mg/mL的PLGA-二氯甲烷溶液中，超聲溶解得油相。在高速剪切力的作用下將油相分散于0.5%PVA的水相中(油水體積比為1∶7.5)，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)一步穩(wěn)定后，在室溫條件下，攪拌揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，即得DEX/CUR-NPs，并考察其外觀形態(tài)、粒徑分布、電位及其包封率。空白納米粒的制備除不加藥物外，其他條件同上。

1.2.3.2 DEX/CUR-NPs體外釋放性能考察 采用動(dòng)態(tài)膜透析法考察DEX/CUR-NPs的體外釋放性質(zhì)[11]。釋放介質(zhì)為含0.5%吐溫-80的0.9%氯化鈉溶液，吸取2 mL DEX/CUR-NPs及等量濃度的DEX、CUR溶液加至已預(yù)處理的透析袋中，并將其置于含20 mL釋放介質(zhì)的離心管，于(37±0.5)℃，50 rpm條件下進(jìn)行釋放，于固定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，測(cè)定納米粒中藥物的累計(jì)釋放率，考察納米粒的體外釋放行為。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，累計(jì)釋放率為縱坐標(biāo)，繪制釋放曲線。

1.2.4 DEX/CUR-NPs體外抗炎活性的研究

1.2.4.1 DEX/CUR-NPs細(xì)胞活力檢測(cè) 按照“1.2.2.1”項(xiàng)下游離藥物細(xì)胞活力的測(cè)定方法，在0.01～10 μmol/L DEX濃度范圍內(nèi)測(cè)定DEX-NPs、CUR-NPs、DEX/CUR-NPs的細(xì)胞存活率，以確定細(xì)胞水平上納米粒抗炎作用研究的安全用藥范圍。

1.2.4.2 DEX/CUR-NPs體外抗炎作用研究 按照“1.2.2.3”項(xiàng)下游離藥物抗炎作用的研究方法，以抑制細(xì)胞分泌NO的量為指標(biāo)，考察DEX/CUR-NPs的體外抗炎活性，實(shí)驗(yàn)中游離DEX、DEX-NPs與DEX/CUR-NPs的DEX濃度為0.001、0.025、0.05、0.1、0.5、1 μmol/L，CUR-NPs的CUR濃度為0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 μmol/L。

1.2.5 DEX/CUR-NPs逆轉(zhuǎn)DEX的MDR的研究 按照“1.2.2.4”項(xiàng)下的方法考察DEX/CUR-NPs逆轉(zhuǎn)DEX的MDR的作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組(Rh-123)，陽(yáng)性對(duì)照組(Rh-123+VER)，DEX-NPs組和DEX/CUR-NPs組(低劑量為0.005 μM DEX，中劑量為0.05 μM DEX，高劑量為0.5 μM DEX)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選DEX與CUR的協(xié)同抗炎比例

2.1.1 游離藥物的細(xì)胞毒性 應(yīng)用MTT法對(duì)游離藥物細(xì)胞活力進(jìn)行測(cè)定，由圖1可知，當(dāng)DEX、CUR藥物濃度均<30 μmol/L；DEX與CUR配伍摩爾比例為1∶3時(shí)，DEX濃度<10 μmol/L；DEX與CUR配伍比為1∶5時(shí)，DEX濃度<1 μmol/L，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明上述濃度可作為細(xì)胞水平藥物抗炎作用研究的安全用藥濃度范圍。

與陰性對(duì)照組比較，***P<0.001。

2.1.2 DEX與CUR協(xié)同抗炎作用結(jié)果 應(yīng)用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法篩選DEX與CUR的協(xié)同抗炎比例。由圖2可知，DEX與CUR均具有抗炎作用，并分別在0.005～10 μmol/L和0.5～30 μmol/L范圍內(nèi)具有劑量依賴性，經(jīng)計(jì)算得DEX單藥的ED50為0.71 μmol/L，CUR單藥的ED50為35.74 μmol/L。繪制兩藥聯(lián)合應(yīng)用在不同配伍比例下的中值效應(yīng)曲線(圖3)與抑制率-協(xié)同指數(shù)圖(圖4)，當(dāng)DEX與CUR配伍比為2∶1、1∶1、1∶3時(shí)，兩藥聯(lián)合應(yīng)用在低劑量時(shí)表現(xiàn)為拮抗作用；當(dāng)DEX與CUR配伍比為1∶5時(shí)，兩藥聯(lián)合應(yīng)用在各個(gè)劑量下均表現(xiàn)為強(qiáng)協(xié)同作用，經(jīng)計(jì)算得ED50為0.13 μmol/L。

圖2 DEX、CUR單藥對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響

A.2∶1；B.1∶1；C.1∶3；D.1∶5

圖4 DEX與CUR聯(lián)合應(yīng)用在不同配伍比例下的FA-CI曲線

2.1.3 CUR對(duì)Rh-123外排的影響 應(yīng)用Rh-123外排實(shí)驗(yàn)考察CUR對(duì)DEX的MDR現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)作用。由圖5-A可知，隨著DEX濃度的增大，胞內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸減弱，這可能是由于DEX可增強(qiáng)細(xì)胞表面P-gp外排泵的活性，促進(jìn)熒光物質(zhì)Rh-123的外排所致。當(dāng)DEX與CUR以配伍摩爾比例1∶3聯(lián)合使用時(shí)，低濃度的CUR(0.015 μmol/L)抑制P-gp活性作用不顯著(P>0.05)(圖5B-1)。當(dāng)兩藥配伍摩爾比例提高至1∶5時(shí)，各個(gè)濃度下的CUR均可顯著抑制P-gp的活性(P<0.05)，且對(duì)P-gp的抑制能力比兩藥配伍摩爾比為1∶3時(shí)增強(qiáng)(P<0.05)(圖5B-1、B-2、B-3)。

A.DEX對(duì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的影響；B-1.低濃度；B-2.中濃度；B-3.高濃度。與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與DEX單藥相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與DEX∶CUR=1∶3相比，&P<0.05，&&&P<0.001。

2.2 DEX/CUR-NPs的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2.1 DEX/CUR-NPs的藥劑學(xué)性質(zhì)表征 采用乳化溶劑揮發(fā)法制備的空白納米粒混懸液的外觀呈白色乳光，DEX/CUR-NPs的外觀呈淡黃色乳光(圖6)。納米粒的外貌形態(tài)通過(guò)TEM進(jìn)行觀察(圖7)，制得的納米粒呈球形，邊界清晰，大小分明。利用Nano-ZS粒度分析儀測(cè)定粒徑及Zeta電位(圖8)，采用超濾法測(cè)定包封率[12]，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 納米粒的藥劑學(xué)性質(zhì)

圖6 空白納米粒混懸液(左)、DEX/CUR-NPs(右)的外觀狀態(tài)

A.空白納米粒；B.DEX/CUR-NPs

A.空白納米粒；B.DEX/CUR-NPs。

2.2.2 DEX/CUR-NPs的體外釋放曲線 應(yīng)用動(dòng)態(tài)膜透析法考察DEX/CUR-NPs的體外釋放性能。由圖9可知，游離DEX與CUR分別在24 h與48 h累計(jì)釋放率達(dá)90%以上；而在DEX/CUR-NPs中DEX與CUR分別在96 h與168 h實(shí)現(xiàn)完全釋放。由此發(fā)現(xiàn)，DEX/CUR-NPs可延長(zhǎng)藥物的釋放時(shí)間，具有一定緩釋作用。

圖9 DEX/CUR-NPs釋放曲線

2.3 DEX/CUR-NPs體外抗炎活性

2.3.1 納米粒的細(xì)胞毒性 應(yīng)用MTT法考察各制劑在不同藥物濃度下的細(xì)胞活力。由圖10-A可知，空白納米粒濃度小于100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明，空白納米粒在該濃度范圍內(nèi)沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性，材料細(xì)胞相容性較好。由圖10-B可知，當(dāng)DEX-NPs與CUR-NPs藥物濃度小于5 μmol/L，DEX/CUR-NPs中DEX濃度小于1 μmol/L時(shí)，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，故上述濃度可作為細(xì)胞水平納米粒抗炎作用研究的安全用藥范圍。

A.空白納米粒；B.載藥納米粒。與對(duì)照組比較，***P<0.001。

2.3.2 DEX/CUR-NPs體外抗炎作用 游離DEX、DEX-NPs、DEX/CUR-NPs的ED50分別為0.5174、0.0056、0.0025 μmol/L。圖11表明，將DEX制成納米粒后，DEX抑制RAW264.7細(xì)胞分泌NO的能力明顯增強(qiáng)；DEX/CUR-NPs抑制炎癥細(xì)胞分泌NO的能力顯著強(qiáng)于各單藥納米粒。這說(shuō)明，DEX與CUR共負(fù)載于納米粒后具有更好的抗炎活性[13]。

圖11 各給藥組抑制NO分泌的中值效應(yīng)曲線

2.3.3 DEX/CUR-NPs逆轉(zhuǎn)DEX的MDR的作用 應(yīng)用Rh-123外排實(shí)驗(yàn)考察DEX/CUR-NPs逆轉(zhuǎn)DEX的MDR作用。由圖12可知，與陰性對(duì)照組相比，DEX-NPS的中、高濃度(0.05、0.5 μM)可顯著降低細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度(P<0.05)。與DEX-NPS相比，DEX/CUR-NPs在低、中、高濃度下(0.005、0.05、0.5 μM)下均可顯著提高細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度(P<0.05)。這說(shuō)明，兩藥共載納米粒在各個(gè)濃度下均可顯著抑制P-gp的活性，從而逆轉(zhuǎn)DEX的MDR作用。

與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與DEX-NPs相比，#P<0.05，###P<0.001。

3 討論

炎癥在各類疾病發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等自體免疫細(xì)胞的激活是炎癥產(chǎn)生和啟動(dòng)的重要環(huán)節(jié)。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受到LPS等外界因素刺激后，機(jī)體炎癥細(xì)胞活化，誘導(dǎo)一氧化氮合酶(iNOs)的合成與表達(dá)，促進(jìn)機(jī)體大量釋放炎癥介質(zhì)NO。NO是免疫細(xì)胞參與機(jī)體免疫代謝反應(yīng)的主要生理性介質(zhì)，在炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用[14]。因此本研究選擇細(xì)胞分泌NO的量作為藥物抗炎作用評(píng)價(jià)指標(biāo)，并應(yīng)用Griess比色法測(cè)定NO的含量[15]。

關(guān)于藥物相互作用的評(píng)價(jià)方法有很多，Chou-Talalay 聯(lián)合指數(shù)法憑借科學(xué)的原理，完備的數(shù)學(xué)模型以及簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)操作等優(yōu)點(diǎn)，成為使用最為廣泛的方法之一[16]。本研究利用上述方法，評(píng)價(jià)DEX與CUR聯(lián)合使用在抗炎方面的作用。研究結(jié)果表明，DEX與CUR均可通過(guò)抑制NO的分泌發(fā)揮抗炎作用，DEX與CUR配伍使用的抗炎作用明顯強(qiáng)于單藥，當(dāng)DEX與CUR配伍摩爾比例為1∶5時(shí)，兩藥在各個(gè)劑量下均可產(chǎn)生良好的協(xié)同抗炎活性。當(dāng)按該比例進(jìn)行投藥，制備的DEX/CUR-NPs的細(xì)胞毒明顯強(qiáng)于DEX、CUR聯(lián)合使用。DEX/CUR-NPs抑制NO分泌的ED50為0.002 5 μmol/L，DEX、CUR聯(lián)合使用的ED50為0.13 μmol/L，說(shuō)明DEX、CUR經(jīng)納米粒包載后可以增加炎癥細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取,從而使DEX/CUR-NPs具有更好的抗炎活性[17]。

藥物MDR現(xiàn)象產(chǎn)生的原因之一是細(xì)胞表面P-gp的過(guò)度表達(dá)，Rh-123作為P-gp的特異性底物，是研究P-gp功能活性最常用的藥物，活化的巨噬細(xì)胞表面高度表達(dá)P-gp[17]。CUR除具有廣泛的抗腫瘤、抗炎等生物活性外，還可通過(guò)抑制細(xì)胞表面P-gp的外排功能，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)藥物MDR的作用。因此本研究選擇LPS活化的RAW264.7細(xì)胞為炎癥模型，采用Rh-123外排實(shí)驗(yàn)考察CUR對(duì)DEX的MDR的逆轉(zhuǎn)作用。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在異硫氰酸酯(Fluoresceineisothiocyanate, FITC)通路上，CUR對(duì)Rh-123的測(cè)定無(wú)干擾，因此利用流式細(xì)胞術(shù)考察CUR在不同配伍摩爾比例下對(duì)DEX的MDR逆轉(zhuǎn)作用。由結(jié)果可知，CUR可以通過(guò)抑制RAW264.7細(xì)胞表面P-gp的外排活性，克服DEX的MDR現(xiàn)象，這也可能是DEX配伍CUR發(fā)揮協(xié)同抗炎作用的潛在機(jī)制[18]。

綜上所述，DEX與CUR聯(lián)合使用既能夠發(fā)揮協(xié)同抗炎作用，又能克服長(zhǎng)期使用DEX過(guò)程中出現(xiàn)的MDR現(xiàn)象。DEX與CUR作為一種抗炎候選組合藥物，具有很大的應(yīng)用潛力。但兩藥在體內(nèi)是否也具有類似協(xié)同抗炎作用還有待于進(jìn)一步研究。