凡納濱對蝦養殖期間水體及腸道菌群變化研究

呂孫建 袁雪梅 張海琪 劉莉 于喆 杭小英 施偉達

摘要：近年，由于凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）養殖業疾病頻發，且病原種類復雜多樣，對對蝦養殖業造成巨大的影響，其中又以細菌病最為普遍及嚴重。以浙江某養殖場的6口養殖塘作為試驗塘，在養殖至20 d后開始分別采用水質監測試劑盒及高通量測序等方法連續監測水質指標、水體及對蝦腸道微生物群變化情況，從而了解在對蝦疾病高發期水體和蝦體中微生物群的動態規律。研究發現隨著養殖時間延長，水體中的氨氮、硫化氫、鈣離子、總氮和總磷等指標會出現顯著上升。另外，養殖塘中的主要微生物群為藍藻細菌綱和變形菌綱類細菌，且藍藻細菌綱和γ-變形菌綱-弧菌微生物群到養殖后期數量顯著上升;對蝦腸道中的主要微生物群為γ-變形菌綱-弧菌，在養殖中期有明顯上升。本研究首次研究了在對蝦疾病高發期水體和蝦體中的主要微生物群種類，為后續病害防控技術研發提供一定的理論依據。

關鍵詞：凡納濱對蝦;微生物群;γ-變形菌綱;藍藻細菌綱

中圖分類號： S945.1+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2021）02-0125-06

收稿日期：2020-06-03

基金資助：浙江省科研院所扶持專項（編號：2020YSZX002、2020YSZX010）。

作者簡介：呂孫建（1988—），男，浙江溫州人，博士，助理研究員，主要從事水產動物病害防治。E-mail：lvsunjian@163.com。

通信作者：張海琪，碩士，正高級工程師，主要從事水產育種和病害防治。E-mail：zmk407@126.com。

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），屬于節肢動物門、甲殼綱、十足目、旅游亞目、對蝦科、對蝦屬，是廣溫廣鹽性熱帶蝦類。該蝦具有個體大、生長快、營養需求低、抗病力強、產量高等優點，是集約化高產養殖的優良品種，也是目前世界上養殖產量最高的三大蝦類之一[1-2]。近年來，由于高密度養殖盛行、藥物濫用、養殖水體惡化和種質退化等原因，凡納濱對蝦養殖業疾病頻發，且病原種類復雜多樣，包括病毒類、細菌類、寄生蟲類、真菌類和原生動物類等，其中又以細菌病最為嚴重，如副溶血弧菌、霍亂弧菌、河流弧菌和其他細菌等條件致病性細菌均能導致對蝦大量死亡[3-5]。

自然條件下，對蝦養殖水體中的微生物群存在一定的動態平衡，病毒、細菌、寄生蟲、真菌和原生動物相互制約并保持水體的穩定，但由于外來物質，如過量飼料投喂、抗生素和化學藥物的濫用[6-7]：一方面擾亂對蝦的免疫系統，極大降低對蝦本身的免疫力;另一方面又導致水體營養成分失衡，水體和對蝦腸道內的微生物群動態平衡紊亂，病原微生物大量增殖，有益微生物大量減少。因此，研究現有養殖環境下，水體和對蝦腸道中微生物菌群的變化，對了解目前對蝦細菌性疾病暴發的原因和后續防控技術的研發具有深遠的意義。據已有的文獻報道，目前關于凡納濱對蝦水體及腸道微生物群動態變化的研究較少，只有少量文章涉及這方面的研究。孫振麗對凡納濱對蝦腸道和水體中的微生物群進行檢測，發現水和蝦腸道中檢測到的共有細菌屬為119株，證明水體和腸道中細菌存在密切的相互作用[8]。宛立等通過分離純化培養法，從健康凡納濱對蝦腸道中檢測到111株細菌，但一些難以培養的優勢菌種或低豐度菌種則檢測不出，因此研究結果不能全面地反映凡納濱對蝦腸道微生物的種群數量及多樣性[9]。李可和劉淮德分別用16S rDNA 克隆文庫法和變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術對凡納濱對蝦腸道菌群進行檢測，均發現了12種細菌，其中李可發現厚壁細菌和變形細菌為對蝦腸道的優勢菌，各占75.4%和246%[10-11]。

本研究擬用高通量測序技術對浙江某凡納濱對蝦養殖場進行連續監測，通過在凡納濱對蝦疾病高發期（養殖從20 d到50 d左右）連續監測水體和對蝦腸道中的微生物菌群，了解養殖期間微生物的動態變化，包括主要微生物種類的變化、各類微生物數量的波動情況，為后續細菌性疾病研究和相應防控產品研發提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1地點

本次研究以浙江某養殖場的6口凡納濱對蝦養殖塘為監測點，從養殖20 d（7月11日）開始采集樣品并檢測，每周采集1次樣品，連續監測5周，至養殖 48 d結束（8月8日）。

1.2方法

1.2.1樣品采集監測塘口采集水樣和對蝦樣品：采集每口養殖塘中心處底層水樣500 mL并4 ℃保存，用于水質檢測和水體微生物菌群檢測;隨機采集每口養殖塘對蝦20 尾，-80 ℃保存，用于對蝦菌群多樣性檢測。

1.2.2水質檢測水質檢測指標包括水溫、溶解氧、pH值、氨氮（NH+4-N）、亞硝酸鹽（NO-2-N）、硫化氫（H2S）、總氮（TN）、總磷（TP）和鈣離子（Ca2+），其中，水溫、溶解氧和pH值采用美國哈希水質分析儀檢測，剩余指標分別使用試劑AmVerTM High Range Ammonia Reagent Set 2606945（0～50 mg/L）、NitriVer3亞硝酸鹽試劑、硫化物試劑盒、Total Nitrogen Hydroxide Reagent Set 2671745（0～25 mg/L）、Calcium Indicaator Solution for Low Range Colorimetric Hardness Test等進行檢測。

1.2.3水體和對蝦腸道微生物菌群分析取各塘口底層水樣50 mL，0.22 μm濾膜過濾，收集濾膜于-80 ℃保存;另將收集的對蝦解剖后，取腸道于 -80 ℃ 保存。將樣品送至上海生工生物科技有限公司進行核酸抽提、16S rDNA建庫和高通量測序。

1.2.4數據統計及分析對全部樣品的 Effective tags進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成OTUs。根據OTUs聚類結果，對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息，根據物種注釋結果，選取每個樣品在門、綱、目、科、屬5個分類級別上最大豐度排名前15的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖。分別統計各養殖水體的所有樣品中均存在的OTU，并進行統計學分析。另水質數據采用“平均值±標準差”表示，采用 SPSS 11.0 對試驗數據進行統計分析，P<0.05 時被認為具有顯著性差異。

2結果

2.1水質指標變化

從養殖20 d開始，至養殖48 d為止，監測塘水溫、pH值、溶解氧、氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫、總氮、總磷、化學需氧量和鈣離子等指標變化情況。由表1可知，水溫變化區間為25.8～29.7 ℃，平均水溫27.7 ℃;pH值變化區間為8.11～9.06，平均pH值8.52;溶解氧濃度的變化區間為4.30～10.89 mg/L，平均濃度為8.93 mg/L。

另由表1可知，氨氮、硫化氫、鈣離子和水體中的總氮和總磷隨養殖時間增加出現明顯上升：氨氮從養殖20 d時的0.26 mg/L升高至41 d時的 1.18 mg/L（P<0.05），隨后下降至0.75 mg/L;硫化氫從養殖20 d時的0.07 mg/L升高至41 d時的0.12 mg/L（P<0.05），隨后下降至0.06 mg/L;鈣離子持續上升，從養殖20 d時的6.10 mg/L升高至 41 d 時的31.44 mg/L（P<0.05）;總氮和總磷持續上升，總磷從養殖 20 d 時的0.39 mg/L升高至 0.52 mg/L（P<0.05）;總氮也從3.20 mg/L升高至4.90 mg/L（P<0.05）。

2.2水體微生物菌群變化

由圖1可知，菌群分析結果顯示，該監測點水體中的微生物分屬于53綱，主要微生物菌群包括藍藻細菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱-弧菌、放線菌綱、酸微菌綱、綠藻綱、Δ-變形菌綱、鞘脂桿菌綱、暖繩菌綱、黃桿菌綱和綠菌綱12個綱，整個監測周期內合計占總微生物群體的比例達到79.62%，其他微生物占比20.38%。

由表2和圖2可知，藍藻細菌綱微生物占比最多，平均占比17.72%，高峰時占比達23.81%，其次為 α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱（弧菌科），占比分別達12.23%、9.33%和7.98%。水體中藍藻細菌綱、γ-變形菌綱-弧菌、暖繩菌綱、Δ-變形菌綱和鞘脂桿菌綱微生物隨著養殖時間推移，占比均有不同程度增加，其中，藍藻細菌綱微生物群占比從養殖20 d時的10.40%上升至41 d時的23.81%;γ-變形菌綱-弧菌微生物群占比則從743%上升至10.05%;暖繩菌綱微生物群占比從1.25%上升至7.69%;Δ-變形菌綱微生物群占比從2.79%上升至5.15%;鞘脂桿菌綱微生物群占比從2.37%上升至6.84%。暖繩菌綱微生物群波動最大，其占比變化區間為0.12%～1.75%，最高值為最低值的14.82倍，其次分別為暖繩菌綱、鞘脂桿菌綱、黃桿菌綱、放線菌綱、綠藻綱、藍藻綱、β變形菌綱、酸微菌綱、Δ-變形菌綱和α變形菌綱，而 γ-變形菌綱-弧菌占比變化最小，其變化區間為684%～1005%，最高值為最低值的1.47倍。

2.3對蝦腸道微生物菌群變化

由圖3可知，該監測點對蝦腸道中的微生物分屬于42綱，主要微生物菌群包括γ-變形菌綱-弧菌、桿菌綱、β-變形菌綱、黃桿菌綱、α-變形菌綱、梭菌綱和藍藻細菌綱7個綱的微生物群，合計占總微生物群體的比例達80.62%，其他微生物占比1938%。

由表3和圖4可知，γ-變形菌綱-弧菌占比最多，平均占比26.35%，高峰時占比達46.24%，其次為桿菌綱和β-變形菌綱，占比分別達15.28%和14.48%。對蝦腸道中γ-變形菌綱-弧菌、α-變形菌綱和藍藻細菌綱微生物隨養殖時間推移，占比均有不同程度的增加，其中，γ-變形菌綱-弧菌微生物群從養殖20 d時的26.79%上升至34 d時的4624%;α-變形菌綱微生物群從養殖20 d時的211%上升至41 d時的12.31%，隨后下降至539%;藍藻細菌綱微生物群從養殖20 d時的038%上升至48 d時的7.42%。藍藻細菌綱微生物群波動最大，其占比變化區間為0.38%～742%，最高值為最低值的19.53倍，其次分別為梭菌綱、β-變形菌綱、α-變形菌綱、黃桿菌綱和γ-變形菌綱-弧菌，而桿菌綱微生物群占比變化最小，其變化區間為558%～10.72%，最高值為最低值的1.92倍。

3討論

凡納濱對蝦由于生活于水體環境中，與水體中的微生物群及水體物理環境直接接觸，因此兩者變化極易影響凡納濱對蝦的健康狀態。由于近年來抗生素、水質調節劑及微生態制劑濫用，導致水體微生態環境紊亂、水生動物疾病頻發。

本研究對浙江某凡納濱對蝦養殖場對蝦養殖至20 d后蝦塘的水質、水體及蝦體微生態菌群進行檢測，了解疾病高發期水體及蝦體中微生態菌群的變化規律。王興強等研究發現，凡納濱對蝦在pH值為7.5～8.5、溶解氧含量為6.8 mg/L的水體中生長較好，溶解氧含量低于4 mg/L則會限制對蝦的生長[12]。本研究中，養殖20～48 d內，水體中的水溫和pH值均較為穩定，平均水溫和pH值分別為27.7 ℃和8.52，而溶解氧最低濃度為4.30 mg/L，平均濃度為 8.93 mg/L，雖然沒有一直維持在最適范圍內，但基本能保證對蝦正常生長[13]。而氨氮、硫化氫、鈣離子和水體中的總氮和總磷含量隨著養殖時間增加出現顯著上升，最高時分別上升至118、0.12、31.44、052、4.90 mg/L，較最低的時候分別上升4.54、1.71、5.15、1.50、1.30倍，這與養殖戶投喂情況相關，隨養殖期的發展，水體中殘余飼料、排泄物、浮游動物尸體等有機物逐漸增多不斷分解使得COD不斷增高，相應的水體中的有機物分解產物，如氨氮、亞硝酸鹽等有害物質含量均會明顯上升，并會對幼蝦及成體蝦造成毒害[14-15]。

菌群分析結果顯示，對蝦養殖塘水體中的微生物菌群分屬于53綱，主要種類有12綱，合計占總微生物群體的比例達79.62%，其中藍藻細菌綱微生物占比最多，平均占比17.72%，高峰時占比達2381%，其次為α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱（弧菌科），占比分別達到12.23%、9.33%和798%。該結果與之前同類研究類似，羅鵬等研究發現凡納濱對蝦養殖水體細菌群落結構復雜，以變形菌綱類微生物群為主，其中又以α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱（弧菌科）為主[16];Zeng等學者也發現變形菌綱為水體中最主要的細菌類群[17-18]。本研究還發現，水體中的藍藻細菌綱微生物群占比較高，其占比甚至高于變形菌綱微生物群，這與水體富營養化嚴重導致的藍藻泛濫有關[17-18]。隨養殖時間推移，水體中的微生物菌群也有一定變化，其中藍藻細菌綱和γ-變形菌綱-弧菌微生物群變化最為明顯，分別從10.40%和743%上升至23.81%和10.05%，這可能與水體中水質指標變化有關，后期養殖水體中的總氮、總磷等營養鹽均有明顯上升。此外，暖繩菌綱微生物群波動最大，其占比變化區間為0.12%～1.75%，最高值為最低值的14.82倍，而γ-變形菌綱-弧菌波動最小，最高值為最低值的1.47倍，說明弧菌在水體中較為穩定，數量變化不如其他微生物群容易受環境變化的影響。

而蝦體腸道中的微生物分屬于42綱，主要種類有7綱，合計占總微生物群體的比例達到80.62%，其中，γ-變形菌綱-弧菌占比最多，平均占比2635%，說明γ-變形菌綱-弧菌是凡納濱對蝦腸道中的主要微生物菌群，其次為桿菌綱和β-變形菌綱。這與之前的研究結果類似，如Beardsley、Liu和Rungrassamee等研究均表明，γ-變形菌綱在對蝦腸道內占絕對優勢，且弧菌屬、氣單胞菌屬為絕對優勢屬，且隨著養殖時間增加，腸道中的變形菌綱和藍藻細菌綱微生物菌群占比均有顯著增加[19-21]。不過也有部分研究發現，γ-變形菌綱并非對蝦腸道優勢菌群，如Tang等分析發現了凡納濱對蝦腸道細菌種群，放線菌門、未分類細菌門、變形菌門和擬桿菌門是優勢菌門，分別占比為53.5%、22.4%、188%和4.32%。所以不同品種的蝦，由于生活環境的差異，可能導致腸道定殖的細菌種類存在差異[22]。

總結本研究發現，隨著養殖時間增加，飼料投喂量增加，水體中的氨氮、硫化氫、鈣離子、總氮和總磷等指標會出現顯著上升。養殖塘中的主要微生物群為藍藻細菌綱和變形菌綱類細菌，且藍藻細菌綱和γ-變形菌綱-弧菌微生物群到養殖后期數量顯著上升;對蝦腸道中的主要微生物群為γ-變形菌綱-弧菌，在養殖中期有顯著上升。

參考文獻：

[1]Devaraja T N，Yusoff F M，Shariff M. Changes in bacterial populations and shrimp production in ponds treated with commercial microbial products[J]. Aquaculture，2002，206（3）：245-256.

[2]Verschuere L，Rombaut G，Sorgeloos P，et al. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2000，64（4）：655-671.

[3]Kong J R，Qiao X L，Yang P，et al. LvCdc42 is a potential negative regulator of Lvp53 in Litopenaeus vannamei exposed to Vibrio alginolyticus stress[J]. Developmental and Comparative Immunology，2018，82：113-117.

[4]Phupet B，Pitakpornpreecha T，Baowubon N，et al. Lipopolysaccharide-and β-1，3-glucan-binding protein from Litopenaeus vannamei：Purification，cloning and contribution in shrimp defense immunity via phenoloxidase activation[J]. Developmental and Comparative Immunology，2018，81：167-179.

[5]楊叢海，趙增元，麻次松，等. 對蝦暴發性流行病綜合防治技術要點[J]. 齊魯漁業，1996，13（3）：5-7.

[6]蔡瑩.對蝦養殖沉積環境細菌多樣性的分子分析與若干可培養技術優化探討[D]. 廈門：廈門大學，2007.

[7]胡夢紅.抗生素在水產養殖中的應用、存在的問題及對策[J]. 水產科技情報，2006，33（5）：217-221.

[8]孫振麗，宣引明，張皓，等. 南美白對蝦養殖環境及其腸道細菌多樣性分析[J]. 中國水產科學，2016，23（3）：594-605.

[9]Wan L，Wang J Q，Gao F，et al. Bacterial flora in intestines of white leg shrimp（Penaeus vannamei Booen）[J]. Fisheries Science，2006，25（1）：13-15.

[10]Li K，Zheng T L，Tian Y，et al. Bacterial community structure in intestine of the white shrimp，Litopenaeus vannamei[J]. Acta Microbiologica Sinica，2007，47（4）：649-653.

[11]Liu H D，Wang L，Wang B J，et al. Analysis on the diversity of microorganism in intestine of Penaeus vannamei-cultured by PCR-DGGE[J]. Feed Industry，2008，29（20）：55-58.

[12]王興強，馬甡，董雙林.凡納濱對蝦生物學及養殖生態學研究進展[J]. 海洋湖沼通報，2004（4）：94-100.

[13]杭小英，周志明，李倩，等. 不同養殖模式對南美白對蝦生長、病害發生與水質的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（5）：191-192，193.

[14]彭自然，臧維玲，高楊. 氨、亞硝酸鹽對凡納濱對蝦幼蝦毒性作用[J]. 上海水產大學學報，2004，13（3）：274-278.

[15]孫國銘，湯建華，仲霞銘.氨氮和亞硝酸氮對南美白對蝦的毒性研究[J]. 水產養殖，2002，22（1）：22-24.

[16]羅鵬，胡超群，張呂平， 等. 凡納濱對蝦海水養殖系統內細菌

群落的PCR-DGGE分析[J]. 中國水產科學，2009，16（1）：31-38.

[17]Zeng Y，Ma Y，Wei C，et al. Bacterial diversity in various coastal mariculture ponds in southeast China and in diseased eels as revealed by culture and culture-independent molecular techniques[J]. Aquaculture Research，2010，41（9）：172-186.

[18]Sakami T，Fujioka Y，Shimoda T. Comparison of microbial community structures in intensive and extensive shrimp culture ponds and a mangrove area in Thailand[J]. Fisheries Science，2008，74（4）：889-898.

[19]Beardsley C，Moss S，Malfatti F，et al. Quantitative role of shrimp fecal bacteria in organic matter fluxes in a recirculating shrimp aquaculture system[J]. FEMS Microbiology Ecology，2011，77（1）：134-145.

[20]Liu H D，Liu M，Wang B J，et al. PCR-DGGE analysis of intestinal bacteria and effect of Bacillus spp. on intestinal microbial diversity in kuruma shrimp （Marsupenaeus japonicus）[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2010，28（4）：808-814.

[21]Rungrassamee W，Klanchui A，Maibunkaew S，et al. Characterization of intestinal bacteria in wild and domesticated adult black tiger shrimp （Penaeus monodon）[J]. PLoS One，2014，9（3）：e91853.

[22]Tang Y，Tao P，Tan J，et al. Identification of bacterial community composition in freshwater aquaculture system farming of Litopenaeus vannamei reveals distinct temperature-driven patterns[J]. International Journal of Molecular Sciences，2014，15（8）：13663-13680.蔣陽陽，李海洋，崔凱，等. 池塘工程化循環水養殖系統水質調控技術研究[J]. 江蘇農業科學，2021，49（2）：131-138.