山東省肉雞養殖場大腸桿菌的分離鑒定及抗藥性監測

趙效南，張印，胡明，張慶，李璐璐，駱延波，許曉輝，劉玉慶

(山東省農業科學院畜牧獸醫研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100)

大腸桿菌是一種常見的人畜共患病病原菌，可導致禽的敗血癥、氣囊炎、輸卵管炎、蜂窩組織炎、心周炎、腹膜炎和卵黃囊感染等，給養禽業造成巨大的經濟損失[1]。動物糞便被認為是大腸桿菌的主要來源。

抗生素主要用于治療或者預防動物疾病，其中一些抗生素被作為飼料添加劑用于促進動物生長[2-4]。由于抗生素不合理的使用，導致耐藥菌株和多重耐藥菌株的出現[5]。據報道，在巴西，商品肉雞多重耐藥大腸桿菌的分離率為71.0%[6]；在意大利，從雞肉中分離出的大腸桿菌66.9%屬于多重耐藥菌[7]；在埃及，禽源大腸桿菌分離株100%屬于多重耐藥菌[8]。耐藥性大腸桿菌可能會通過食物鏈傳遞給人類，造成人類感染治療的失敗，從而對公共安全造成危害[9]。

山東是我國肉雞養殖大省，商品肉雞年出欄量在16.5億只。由于抗生素的不合理使用，導致動物源耐藥菌大量產生和快速傳播。因此對肉雞養殖場大腸桿菌的抗藥性進行持續監測是非常必要的。本研究于2018—2019年從山東省3個規模化養雞場中采集新鮮糞便樣品，對其進行大腸桿菌的分離鑒定和抗藥性分析，旨在了解山東地區養雞場耐藥特點，為養殖場抗生素的合理使用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018—2019年從山東省3個規模化肉雞養殖場采集123份新鮮糞便樣品，每個養雞場規模均超過15萬只。樣品采集后，置于無菌采樣袋中，并放置于冰盒中，立即帶回實驗室進行細菌學分析。

1.2 大腸桿菌的分離與鑒定

取約2 g新鮮糞便至5 mL胰蛋白酶大豆肉湯培養基中，37℃孵育24 h，然后取100 μL涂布于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養18～24 h，挑取粉紅色、邊緣光滑濕潤的扁圓菌落進行純化，對純化后的可疑單菌落進行革蘭氏染色和生化試驗。利用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取細菌DNA，通過PCR擴增16S rRNA基因，上游引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物為1429R：5′-GGTTACCTTGTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系(25 μL)：H2O 18.375 μL，Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶 0.125 μL。反應程序：94℃ 10 min；94℃ 30 s，52℃ 50 s，72℃ 1 min，32個循環；72℃ 5 min。擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果與GenBank 數據庫進行比對。陽性菌株使用胰蛋白酶大豆肉湯甘油(20%)在-20℃下保存。

1.3 藥敏試驗

采用美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法對大腸桿菌分離株進行11種常用抗生素的敏感性試驗，包括氟苯尼考、慶大霉素、阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻呋、多粘菌素、新霉素、恩諾沙星、美羅培南、多西環素、氨芐西林和安普霉素。以大腸埃希氏菌ATCC25922作為質控菌株。藥物敏感試驗結果通過2018年CLSI標準[10]和歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會(http://www.eucast.org/ Clinical.breakpoints)進行評估。如對3類或3類以上抗生素耐受，則判定為多重耐藥菌。

1.4 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2016軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌的分離和鑒定結果

大腸桿菌分離株革蘭氏染色鏡檢結果為革蘭氏陰性菌，兩端鈍圓，短小呈桿狀。生化試驗特征：V-P試驗為陰性、吲哚試驗為陽性、產酸不產氣、不分解尿素，發酵甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖等。通過16S rRNA 基因測序比對，最終從3個規模化肉雞養殖場123份新鮮糞便樣品中共分離到123株大腸桿菌。

2.2 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果(圖1)顯示，123株大腸桿菌分離株對11種抗生素的耐藥率在0～100%。所有分離株對多西環素耐藥、對美羅培南敏感；大多數大腸桿菌分離株耐藥率超過50%。由表1可知，對9種抗生素耐藥的菌株多達34株，對8種抗生素耐藥的菌株有28株，對10種抗生素耐藥的菌株有26株，對7種抗生素耐藥的菌株有24株，對6種抗生素耐藥的菌株有5株，對5種抗生素耐藥的菌株有3株，對4種抗生素耐藥的有2株。其多重耐藥率為99.2%。

圖1 藥敏試驗結果

表1 大腸桿菌耐藥譜

3 討論與結論

大腸桿菌是人和動物腸道內的常見菌，且廣泛存在于自然界中，在一定條件下可引起動物的敗血癥、腸炎等疾病，對畜牧養殖業造成巨大的經濟損失[11]。為了解山東地區養雞場大腸桿菌的耐藥特點，本試驗于2018—2019年通過采集3個規模化養雞場的新鮮糞便樣品，分離并鑒定出123株大腸桿菌，并對大腸桿菌的抗藥性進行監測。

由于抗生素在養殖業的濫用，導致高抗或多抗大腸桿菌不斷被檢出。大腸桿菌的耐藥性已經對公共衛生安全造成嚴重威脅。本研究藥敏試驗結果顯示，大腸桿菌分離株對多西環素的耐藥率高達100%，與Jahantigh等[2]報道的從感染大腸桿菌的雞場中分離的大腸桿菌對多西環素耐藥率高達96%一致[2]。多西環素的副作用小，且價格低廉，是治療和控制各種家禽疾病最常用的抗生素[12，13]。大腸桿菌對多西環素的高耐藥率與養殖場中過度使用該類抗生素有關。本研究中大腸桿菌分離株對氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、氟苯尼考、頭孢噻呋、多粘菌素、新霉素、慶大霉素和恩諾沙星的耐藥率達到50%以上。王志浩等[14]報道的山東省雞源大腸桿菌對氨芐西林和氟苯尼考的耐藥率在67%以上，對頭孢菌素類抗生素耐藥率高達38.4%～44.9%，對氟喹諾酮類抗生素耐藥率在26.8%～50.0%。Adesiyun等[15]研究表明，大腸桿菌分離株對四環素類抗生素的耐藥率在58.5%，對氟喹諾酮類抗生素耐藥率在9.3%～25.4%。Jahantigh等[16]試驗結果表明，從雞中分離的大腸桿菌對氟喹諾酮類抗生素耐藥率在17%～100%，對頭孢菌素類抗生素耐藥率在50%，對四環素類抗生素耐藥率在95%。本研究結果與以上報道一致，表明養雞場中大腸桿菌的耐藥性非常嚴重。本試驗中所有大腸桿菌分離株對美羅培南敏感，這可能與養殖場中很少使用這種抗生素有關。

多重耐藥大腸桿菌的出現對公共衛生構成威脅。本研究表明養雞場中99.2%大腸桿菌呈多重耐藥性且耐藥譜大多在7種以上，與報道的禽源大腸桿菌分離株多重耐藥率為100%結果一致[8]，但遠遠高于吳少鵬等[17]報道的山東省某地區奶牛源大腸桿菌的多重耐藥率(22.2%)。這可能與地域、物種、養殖場用藥不同有關。

肉雞是人類蛋白質的主要來源，但其容易感染大腸桿菌，因此養雞場應做好管理，避免繼發細菌感染。為降低大腸桿菌的抗藥性，應防止包括肉雞在內的食用動物中抗生素的濫用。