水稻籽粒厚度基因GT1的連鎖分析

李陛方

（蕉嶺縣長潭鎮農業農村服務中心，廣東 梅州 514185）

水稻是中國的第一大糧食作物，隨著我國人口的不斷增長，預計到2030年，我國糧食總量將要從2010年的5.8億噸增至7.4億噸方能滿足需要[1-2]，因此，提高水稻產量對我國的糧食安全具有重要的意義。

影響水稻產量最重要的因素之一是水稻的籽粒性狀，包括粒重、粒長、粒寬、粒厚和長寬比等，而且水稻籽粒性狀已成為水稻高產優質分子設計育種的重要靶標性狀[3]。其中粒厚是水稻籽粒性狀的重要組成部分，是水稻重要的經濟性狀。熊振民和孔繁林通過對秈稻的9個雜交組合進行研究，發現水稻的籽粒性狀中粒厚與粒重的關系最為密切，粒厚是受多基因控制的粒形性狀[4]。水稻粒厚性狀的遺傳機制較為復雜，同時國內外學者對水稻粒厚性狀的遺傳研究報道也較為少見，因此有必要對水稻粒厚性狀進行適當的研究。

經多年觀察，水稻的粒厚性狀與巨胚性狀可能存在連鎖遺傳，本研究通過調查分析表現型為厚粒正常胚的水稻品種XHZ和表現型為薄粒巨胚的水稻品種JPHN兩親本雜交后代F2群體的田間表現，證明巨胚性狀與粒厚性狀的連鎖關系，然后利用巨胚基因GE附近的一些分子標記引物對兩個親本進行多態性標記篩選，嘗試對粒厚基因GT1作進一步的定位分析。通過定位粒厚基因，尋找控制粒厚的關鍵基因，為今后開展進一步的粒厚基因精細定位、克隆和功能分析，對闡明水稻籽粒性狀遺傳控制和產量形成的機理，具有重要的研究意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

兩個水稻品種：XHZ和JPHN為親本材料。XHZ是水稻品種新黃占，該品種的籽粒為厚粒，胚為正常胚；JPHN是水稻品種巨胚黑糯，該品種的籽粒為薄粒，胚為巨胚。

1.2 方法

1.2.1 提取親本DNA進行多態性標記篩選

預計巨胚性狀與粒厚性狀連鎖，在巨胚基因附近設計了9對分子標記物在兩親本間進行多態性標記篩選。9對分子標記的引物序列以及片段大小見表1。

表1 用于兩親本間多態性篩選的分子標記

1.2.2 提取DNA并進行PCR擴增

提取兩個親本材料XHZ和JPHN的DNA，然后，使用適當的引物分別對其進行PCR擴增。運行反應的程序為：95℃變性4 min，循環（95℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃適溫延伸 40 s），一共 40 個循環，72℃延伸10 min，最后 15℃保存[5]。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR擴增產物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，觀察電泳圖譜的成像結果，拍照分析并保存。

1.2.4 田間種植

利用這兩個品種XHZ和JPHN進行雜交得到其親本及F1代雜交種子。進行篩選工作剔除假雜種，播種F2代種子，后進行插秧工作，田間種植26行，以數字編號1～26，每行40株，以數字編號1～40，插秧時確保單本插秧。統一栽培管理，保持田間肥水一致，得到F2代群體約1 000株。水稻成熟時，在約1 000株系中每個株系隨機收獲3穗，自然晾干后進行考種工作。

1.2.5 巨胚的觀察與統計

在每個樣本中，隨機選取5粒完整無損的稻谷，剝去稻殼，露出完好的稻米籽粒，觀察胚的大小，記錄出現巨胚的樣本。

1.2.6 粒厚的測定

水稻籽粒厚度的測定標準參照《水稻種質資源描述規范和數據標準》[6]。實驗方法：隨機數取完整無損的10粒稻谷，將稻谷肩并肩側豎于膠帶上，使其不傾斜，不留縫，測出厚度，每份材料重復測量2次，取其平均值即為粒厚。

1.2.7 數據分析

利用Excel軟件計算水稻粒厚的均值，統計F2群體中厚粒正常胚、薄粒巨胚、厚粒正常胚和厚粒巨胚四種表現型的樣本數目，觀察其頻率分布并計算重組率，判斷粒厚與巨胚之間是否存在連鎖。

2 結果與分析

2.1 親本的表型分析

測量兩親本的粒厚，并觀察其胚型。兩親本的表型情況見表2。親本XHZ的粒厚性狀表現為厚粒，胚的性狀表現為正常胚；親本JPHN的粒厚性狀表現為薄粒，胚的性狀表現為巨胚。

表2 兩親本的表現型

2.2 巨胚與粒厚的連鎖分析

F2群體四種表現型的分離情況如表3所示。在F2群體中，厚粒正常胚和薄粒巨胚為親本型，薄粒正常胚和巨胚為重組型，根據重組率的計算公式：重組率（%）=（重組型個體數/測交子代的個體總數）×100%，可以計算出F2群體1～8、9～16、17～26及總群體1～26的重組率分別為25.60%、24.40%、28.50%和26.40%。因此，可以知道控制巨胚的基因與控制粒厚的基因存在連鎖關系。粒厚與巨胚兩個基因之間的重組率為26.40%，連鎖距離為26.40 cm。

表3 F2群體各表型的分離情況及重組率

2.3 親本間多態性標記篩選

因為水稻巨胚基因GE與粒厚基因GT1是連鎖的，在巨胚基因GE附近找到這9對分子標記引物：GT01、GT02、GT03、PSM353、RM505、PSM432、RM234、RM18 和RM47，對兩個親本XHZ和JPHN進行多態性分子標記篩選，結果顯示并未能利用這9對分子標記引物篩選到兩者存在多態性，因此無法對粒厚基因進行進一步的定位分析。

3 結論

本研究對XHZ和JPHN兩個親本雜交后代F2群體四種表型，即厚粒正常胚、薄粒巨胚、薄粒正常胚和厚粒巨胚的分離情況進行統計分析后發現，水稻籽粒厚度基因與巨胚基因是連鎖的，根據重組率計算公式可以計算出兩個基因之間的重組率為26.40%，連鎖距離為26.40 cm。

本研究通過統計分析XHZ和JPHN雜交后代F2四種表型的分離情況，驗證了水稻巨胚基因與籽粒厚度基因的連鎖關系，然后利用了巨胚基因GE附近的9對分子 標 記 引 物 ：GT01、GT02、GT03、PSM353、RM505、PSM432、RM234、RM18和RM47，試圖使用這些引物在兩個親本XHZ和JPHN之間進行多態性分子標記篩選，嘗試對水稻籽粒厚度基因作進一步的基因定位。然而在實際操作中，未能成功地利用這9對分子標記引物篩選出兩個親本的多態性，無法進行下一步的粒厚基因定位。因此，今后應使用更多的分子標記引物去進行它們的多態性分子標記篩選，完成水稻籽粒厚度基因的定位分析。對粒厚基因進行定位分析，可以幫助了解水稻產量性狀的分子調節機制，同時也可以在生產實踐中提高水稻產量提供更多的利用途徑。隨著更多的水稻籽粒性狀相關基因的定位、QTL克隆和相關功能研究，將會更加了解水稻籽粒性狀控制的分子機制，掌握水稻產量性狀復雜的遺傳機理，為水稻高產分子育種提供相應的理論依據，并在水稻分子育種的實踐中得到應用。