表皮生長因子受體、自噬相關蛋白5、p62蛋白在甲狀腺乳頭狀癌合并頸部淋巴結轉移中的表達及臨床意義

吳彬，陶娟，佟萌，聶琛

大連大學附屬中山醫院乳腺甲狀腺外科，遼寧 大連 116001

甲狀腺乳頭狀癌（papillary carcinoma of thyroid，PTC）是甲狀腺癌的高發類型，約占甲狀腺癌的85%，但其發病機制目前仍未完全明確。盡管PTC的診療手段不斷發展，但由于PTC患者易發生淋巴結轉移，預后依然很差。自噬是細胞適應內外部環境變化的能動過程，細胞內部分胞質、蛋白質和變性壞死的細胞器與自噬泡中的溶酶體融合形成自噬溶酶體，并降解產生氨基酸、核苷酸供細胞再利用的循環過程，也被稱為Ⅱ型程序性死亡，屬于細胞正常的功能，這一功能在進化過程中高度保守。研究表明，自噬在腫瘤細胞生長、發育、成熟及死亡過程發揮著不同的作用。研究顯示，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）與腫瘤細胞的發生、發展密切相關，在多種實體腫瘤中呈異常高表達，此外，EGFR通過調節多條信號轉導通路參與細胞的自噬過程。目前，自噬與EGFR是否相互作用共同促進甲狀PTC合并頸部淋巴結轉移的發展尚不清楚，因此，本研究探討EGFR和自噬相關蛋白5（autophagy related protein 5，ATG5）、p62蛋白在PTC組織和頸部轉移淋巴結中的表達，并探討其臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年3月至2015年2月大連大學附屬中山醫院收治的PTC患者。納入標準：均經病理學檢查確診為PTC；術前均未進行放化療和其他治療；3年隨訪資料完整。排除合并其他腫瘤的患者。依據納入和排除標準，本研究共納入80例PTC患者，男28例，女52例；年齡40～79歲，平均（48.32±12.23）歲；＜45歲32例，≥45歲48例；按照2009版國際抗癌聯盟TNM分期標準：I～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期41例；腫瘤直徑：＜1 cm 35例，≥1 cm 45例；分化程度：高分化26例，中分化32例，低分化22例；淋巴結轉移45例，無淋巴結轉移35例。取80例PTC患者的PTC組織及相應的癌旁正常組織，同時取其中合并頸部淋巴結轉移的45例患者的轉移淋巴結組織標本，所有組織標本10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，用于后續實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要抗體和試劑 兔抗人EGFR多克隆抗體、兔抗人ATG5單克隆抗體，p62單克隆抗體均購自北京奧維亞生物技術有限公司，鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）試劑盒購自美國Abcam公司，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 免疫組化法檢測EGFR、ATG5和p62蛋白的表達情況 石蠟切片，置于40%乙醇中40℃水浴4 min，置于60℃烘箱中烘片，二甲苯脫蠟20 min，梯度乙醇水化，加入3% HO，室溫10 min，阻斷內源性過氧化物酶的活性。對EGFR、ATG5、p62蛋白進行高溫高壓組織修復，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗，加入5%羊血孵育30 min。除去封閉液，加入一抗，4℃冰箱過夜，PBS代替一抗作為陰性對照，次日取出PBS沖洗；滴加二抗，室溫下孵育30 min，PBS沖洗5次，每次3 min。DAB顯色，PBS沖洗終止顯色，然后水沖洗，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水干燥，光學顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 判定標準 光學顯微鏡下觀察制備好的切片，陽性為細胞質內呈棕黃色顆粒，由兩名病理科醫師獨立進行評估，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野（×400），通過染色強度和陽性細胞所占比例進行評估。染色強度：無著色計0分，淡黃色染色計1分，棕黃或棕褐色染色計2分。陽性細胞所占比例：無陽性細胞計0分，陽性細胞所占比例＜25%計1分，陽性細胞所占比例25%～50%計2分，陽性細胞所占比例51%～75%計3分，陽性細胞所占比例＞75%計4分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相乘，＞3分判定為陽性，≤3分判定為陰性。

1.3 隨訪方法

PTC患者均以電話、門診等方式多所有患者進行為期3年的隨訪，隨訪截止時間為2018年2月，總生存時間（overall survival，OS）為從手術至隨訪結束或死亡時間。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件對所有數據進行統計學分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ檢驗；相關性分析采用Spearman相關分析；采用Graphpad prism 5軟件繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗，PTC患者預后情況的影響因素采用Cox風險比例回歸模型分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR、ATG5、p62蛋白表達情況的比較

PTC組織和轉移淋巴結組織中EGFR、p62蛋白的陽性表達率均高于癌旁正常組織，ATG5蛋白的陽性表達率均低于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（

P

＜0.05），但PTC組織與轉移淋巴結組織中EGFR、ATG5、p62蛋白的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。（表1）

表1 不同組織中EGFR、ATG5、p62蛋白陽性表達率的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征PTC患者PTC組織中EGFR、ATG5、p62蛋白陽性表達率的比較

不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度PTC患者PTC組織中ATG5蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）；不同TNM分期和淋巴結轉移情況PTC患者PTC組織中ATG5蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（

χ

=9.756、6.318，

P

＜0.05）。不同性別、年齡和腫瘤直徑PTC患者PTC組織中p62蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）；不同分化程度、TNM分期和淋巴結轉移情況PTC患者PTC組織中p62蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（

χ

=7.166、6.983、4.876，

P

＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期和淋巴結轉移情況PTC患者PTC組織中EGFR蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征PTC患者PTC組織中EGFR、ATG5、p62蛋白陽性表達率的比較（n=80）

2.3 EGFR、ATG5、p62蛋白表達的相關性分析

Spearman相關分析結果顯示，PTC組織中，EGFR的表達與ATG5、p62無明顯相關性（

r

=0.042、0.116，

P

＞0.05），ATG5的表達與p62呈負相關（

r

=-0.656，

P

＜0.01）；在轉移淋巴結組織中，EGFR的表達與ATG5、p62無明顯相關性（

r

=0.071、0.136，

P

＞0.05）；ATG5的表達與p62呈負相關（

r

=-0.562，

P

＜0.01）。

2.4 PTC組織中EGFR、ATG5、p62蛋白的表達對PTC患者預后的影響

對80例PTC患者進行為期3年的隨訪，病死22例，3年生存率為72.50%（58/80）。p62陽性表達PTC患者的3年生存率為65.52%（38/58），低于陰性表達患者的90.91%（20/22），差異有統計學意義（

χ

=5.158，

P

=0.023）；EGFR和ATG5陽性表達PTC患者的3年生存率分別為67.69%（44/65）、94.12%（16/17），與EGFR和ATG5陰性表達患者的93.33%（14/15）、66.67%（42/63）比較，差異均無統計學意義（

χ

=2.836、3.777，

P

＞0.05）。

2.5 PTC 患者預后影響因素的Cox 風險比例回歸模型分析

將TNM分期、淋巴結轉移情況、EGFR表達情況、ATG5表達情況和p62表達情況作為自變量，以患者的預后作為因變量，納入Cox風險比例回歸模型，結果顯示，TNM分期、淋巴結轉移、EGFR陽性表達、p62陽性表達為PTC患者預后的獨立危險因素（

P

＜0.05），ATG5陽性表達為PTC患者預后的獨立保護因素（

P

＜0.05）。（表3）

表3 PTC患者預后影響因素的Cox風險比例回歸模型分析

3 討論

PTC是甲狀腺惡性腫瘤中最為常見的類型，好發于中青年女性，且容易較早發生淋巴結轉移，嚴重威脅患者的生命安全。研究表明，多個癌基因及抑癌基因參與了PTC的發生發展過程，深入探討相關蛋白的表達有利于進一步明確腫瘤的發病機制，同時可提高臨床分子診斷的準確性，有助于改善患者的預后。

細胞死亡根據形態學表型不同分為I、Ⅱ、和Ⅲ共3種類型，分別指凋亡、自噬性細胞死亡和細胞壞死。自噬廣泛存在于細胞的生理活動中，正常細胞通過自噬可以清除細胞內廢物，維持細胞內環境及基因組的穩定，同時也是一種細胞對抗營養缺乏、電離輻射等不良環境的防御機制，在抑制炎性反應或腫瘤的生長過程中發揮重要作用。但有研究表明，自噬活性受損傷后可促進細胞病變和腫瘤的進展。微環境決定了自噬在腫瘤發展中的作用，腫瘤細胞中自噬相關蛋白可出現異常表達，其異常表達成為研究腫瘤發生及抑制腫瘤發展的熱點。

ATG5位于人類染色體6q21，編碼276個氨基酸，在自噬相關基因ATG嚴格調控自噬的過程中發揮關鍵作用，ATG5首先與ATG12結合，形成的ATG5-ATG12泛素樣連接系統連接到外膜，自噬體膜延伸，進而形成自噬體，巨噬細胞因缺乏ATG5導致吞噬體不能與溶酶體相互融合。有研究表明，ATG5參與多種腫瘤的發生發展過程，其中胃癌、結腸癌和卵巢癌組織中因ATG5基因突變降低相應蛋白表達量。本研究發現，PTC組織及轉移的淋巴結組織中ATG5的陽性表達率低于癌旁正常組織，推測ATG5也可能參與了PTC的發生發展過程。TNM分期、淋巴結轉移是評估PTC惡性程度的重要指標，本研究結果顯示，不同TNM分期和淋巴結轉移情況PTC患者PTC組織中ATG5蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示ATG5陰性表達和PTC的生物學行為可能有關，進一步生存分析結果顯示，不同ATG5表達患者3年生存率無明顯差異，而Cox風險比例回歸模型結果顯示，ATG5陽性表達是PTC患者預后的保護因素，說明ATG5陽性表達與PTC患者預后存在一定關系，但只檢測ATG5不能很好的反映患者的預后情況。

p62是一種自噬底物連接蛋白，具有多個結構域，可與泛素化修飾的待降解蛋白結合并將其運輸至自噬泡中降解。細胞質中p62在正常細胞自噬過程中不斷被降解，而自噬功能出現缺陷或失活后，會導致p62蛋白在細胞質中累積，因此，p62可以作為反映細胞自噬活性的標志性蛋白。研究表明，p62濃度增加會促進活性氧的累積，進而導致細胞內質網發生應激反應和DNA損傷，此外，核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路及下游基因的表達也會受到p62積累的影響而上調促腫瘤炎性反應。通過自噬降低細胞內p62的水平是抑制腫瘤形成的機制之一。Beclin 1是在哺乳動物中第一個被發現的調節自噬過程的抑癌基因，而p62可使Beclin 1蛋白和B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）分離，釋放出Beclin 1蛋白而促進自噬活性。本研究發現，PTC組織及轉移淋巴結組織中p62蛋白的陽性表達率均高于癌旁正常組織，表明p62可能參與了PTC的發生發展過程。進一步分析顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和分化程度為低分化的PTC患者PTC組織中p62蛋白陽性表達率高于TNM分期為I～Ⅱ期和分化程度為高分化的患者，說明p62陽性表達能夠間接反映PTC的惡性生物學行為。相關性分析結果顯示，PTC組織及轉移淋巴結組織中p62的表達與ATG5呈負相關，提示二者之間存在一定的聯系，可能是因為腫瘤組織中內環境發生改變后影響了指標之間的相互表達。隨訪結果顯示，p62陽性表達PTC患者的3年生存率為65.52%，低于陰性表達患者的90.91%，Cox分析結果顯示，p62陽性表達可作為評估PTC患者預后的獨立危險因素。

EGFR是由原癌基因表達，與其配體表皮生長因子、轉化生長因子結合后導致細胞內酪氨酸殘基發生磷酸化，通過多個信號通路影響細胞生長和凋亡過程，此外，EGFR酪氨酸激酶能夠使Beclin 1磷酸化而抑制自噬活性，EGFR還可根據其具有的激酶非依賴活性促進細胞存活。研究表明，EGFR在多種實體瘤中均呈高表達。本研究結果與之類似，PTC組織和轉移淋巴結組織中EGFR陽性表達率均高于癌旁正常組織，表明EGFR與PTC的發生發展關系密切；進一步結果顯示，EGFR的表達與PTC患者的臨床特征和3年生存率均無關。鄔琳和郭金珠的研究發現，EGFR與宮頸癌患者臨床特征均無明顯相關性，與本研究結果類似，但也可能與納入的臨床樣本量較少有關。本研究發現，EGFR表達與自噬相關蛋白ATG5和p62無相關性，這可能因為自噬的調節與EGFR磷酸化水平有關，而總EGFR蛋白表達水平不能反映磷酸化程度從而與自噬相關性不顯著。但本研究發現，EGFR也可作為PTC患者預后的獨立預測因素。

綜上所述，PTC組織及淋巴結轉移組織中EGFR、p62的陽性表達率較高，ATG5的陽性表達率較低，三者可作為PTC患者預后的獨立預測因素，此外，ATG5和p62與PTC生物學行為有關，可能成為PTC診斷的潛在指標。