曹龍龍，謝建偉，李平，鄭朝輝，黃昌明

福建醫科大學附屬協和醫院胃外科，福州 350001

胃癌是一種嚴重的公共健康問題。據報道，全世界每年胃癌發病數量超過951 600例，現已成為第三大腫瘤相關死亡病因。胃癌的發病機制復雜，預后差，病死率高。盡管胃癌的綜合治療措施不斷完善，但仍未能獲得滿意效果。近年來，對免疫檢查點的阻斷已進行了積極研究，并已為多種惡性腫瘤（如轉移性黑色素瘤和非小細胞肺癌）帶來了巨大的臨床獲益。但是，研究發現多種腫瘤類型中只有不到40%的病例對程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）/程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）阻斷有反應，并且據報道腫瘤對免疫療法有主要或次要抵抗力。細胞周期蛋白依賴蛋白激酶5（cyclin-dependent protein kinase 5，CDK5）屬于周期蛋白依賴蛋白激酶（CDK）家族成員。既往研究顯示，CDK5除了參與神經細胞的調控外，還參與了多種腫瘤的發生發展及凋亡過程。最近研究顯示，CDK5的缺失可通過干擾PD-L1的表達而參與腫瘤免疫逃逸。然而，關于CDK5是否影響腫瘤免疫浸潤細胞的類型和數目尚不清楚。本研究收集36例胃癌患者的胃癌石蠟組織，并通過生物信息學分析，探討CDK5表達是否影響胃癌免疫細胞浸潤，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

從公共數據庫癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA；https://portal.gdc.cancer.gov/）及基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中獲取胃癌患者高通量測序數據集。TCGA數據集中納入包含完整臨床資料的358例胃癌組織（T）及22例癌旁組織（N）。GEO數據庫中選取包含胃癌組織和癌旁組織或健康者胃黏膜組織（H）、組織樣本共大于50例且已發表相關文獻或文獻引用次數大于3次的數據集，本研究共納入4個GEO數據集：GSE66229（T為300例，N為100例）、GSE122401（T為80例，N為80例）、GSE54129（T為111例，H為21例）、GSE13911（T為38例，N為31例）。同時，選取2015年2—6月于福建醫科大學附屬協和醫院診斷為胃癌的36例患者，所有患者均接受根治性手術，且病歷資料齊全。根據CDK5表達水平將36例胃癌患者分為CDK5低表達組22例和CDK5高表達組14例。CDK5低表達組中，男14例，女8例；平均年齡（59.6±4.2）歲；腫瘤部位：胃底部7例，胃體部4例，胃竇部10例，混合型1例；平均腫瘤大小（3.6±0.8）cm；TNM分期：I期1例，Ⅱ期8例，Ⅲ期13例。CDK5高表達組中，男8例，女6例；平均年齡（60.7±3.8）歲；腫瘤部位：胃底部3例，胃體部5例，胃竇部6例，混合型0例；平均腫瘤大?。?.9±0.6）cm；TNM分期：I期 2例，Ⅱ期 6例，Ⅲ期 6例。兩組患者各基線特征比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經福建醫科大學附屬協和醫院倫理委員會批準，所有患者知情同意并簽署知情同意書，同意將其信息存儲在醫院數據庫中并用于研究。

1.2 免疫組織化學染色

將36例患者經福爾馬林固定、石蠟包埋的腫瘤組織切片（厚度為4 μm）用CDK5或CD8進行免疫組織化學染色。將載玻片在65℃烘烤2 h，用二甲苯脫蠟，然后在梯度酒精中水化。使用檸檬酸緩沖溶液通過高壓方法對載玻片進行抗原修復。內源過氧化物酶用3% HO滅活，用1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）進行孵育，以阻斷非特異性結合。隨后，將載玻片與抗CDK5抗體（1∶200稀釋）或抗CD8抗體（1∶100稀釋）在4℃孵育過夜。正常山羊血清作為陰性對照。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后，將組織切片與二抗在室溫下孵育20 min，然后用二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色。最后，將載玻片用蘇木精復染色，脫水，并蓋上蓋玻片。對CDK5染色切片評分：根據染色強度分為0分（無染色）、1分（弱染色，淺黃色）、2分（中等染色，黃棕色）、3分（強染色，棕色）；根據陽性細胞的比例分為0分（≤5%陽性細胞）、1分（6%～25%陽性細胞）、2分（26%～50%陽性細胞）、3分（≥51%陽性細胞）。兩項得分相乘結果≥4分為高表達，反之為低表達。本研究中，根據CDK5表達水平將36例胃癌患者分為CDK5低表達組22例和CDK5高表達組14例。對CD8染色切片評分：評估腫瘤中心每高倍鏡視野的CD8T淋巴細胞數，統計5個視野中CD8T淋巴細胞的平均數。

1.3 基因富集分析

1.4 CIBERSORT免疫細胞組分評估

通過CIBERSORT（https：//cibersort.stanford.edu/）的22種免疫細胞類型基因標簽（通過估計相對表達鑒定細胞類型）計算基因表達數據集的絕對免疫細胞評分（模型設為絕對，排列等于100，禁用RNA-Seq數據的分位數歸一化）。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 胃癌相關免疫信號通路及免疫細胞浸潤

采用GSEA評估公共數據庫中胃癌相關信號通路激活情況。相較于癌旁組織，細胞周期相關基因集（E2F_targets、G2M_checkpoint等）及上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）基因集在胃癌中的標準化富集分數（normalized enrichment score，NES）最高。而負性調控KRAS通路的基因集（Kras_signaling_dn）及脂肪酸代謝基因集在癌旁組織中顯著富集。此外，代表同種異體移植物排斥反應的基因集在5個胃癌數據集中均顯著富集，提示機體免疫反應在胃癌進展過程中發揮重要作用。為進一步評估胃癌的免疫微環境，本研究收集了11個免疫相關基因集進行富集分析，結果顯示所有免疫相關基因集均在胃癌中顯著富集（圖1）。采用ssGSEA評估顯示，周圍炎癥基因集在胃癌組織中評分明顯高于癌旁組織（P＜0.01）。采用CIBERSORT軟件對TCGA樣本進行免疫細胞組分評估，發現癌旁組織中記憶B細胞浸潤高于腫瘤組織（P=0.039），而腫瘤組織中巨噬細胞M型、M型及M型數目均明顯多于癌旁組織（P＜0.01）。

圖1 胃癌免疫相關基因集的富集情況

2.2 CDK5相關的免疫信號通路

采用GSEA分析胃癌公共數據庫中與CDK5相關的免疫基因集。相較于CDK5低表達患者，周圍炎癥基因集等免疫增強基因集在CDK5高表達患者中顯著富集（圖2A）。且在周圍炎癥基因集中，與免疫密切相關的基因ⅡA型磷脂酶A2（phospholipase A2 groupⅡA，PLA2G2A）、趨化因子配體 10（C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10）及腫瘤壞死因子受體超家族成員12A（tumor necrosis factor receptor superfamily member 12A，TNFRSF12A）等在兩組患者中差異最顯著[Log2（FC）＞1，圖2B]。對11個免疫相關基因集采用ssGSEA分析進一步顯示，周圍炎癥基因集及抗原提呈細胞共刺激基因集在CDK5高表達患者中評分均明顯高于CDK5低表達患者（P＜0.01）。上述結果表明，CDK5高表達的胃癌組織可能引起機體更強的免疫細胞浸潤。

圖2 GSEA分析CDK5高表達組與低表達組中周圍炎癥基因集的富集情況

2.3 CDK5與免疫相關基因及免疫浸潤細胞的相關性

根據既往文獻報道，發現包括CD274、PD-L2、PD-1、CD80、CD86、毒性 T 淋巴細胞相關蛋白 4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）、主要組織相容性復合物I型-C（major histocompatibility complex，classI，C，HLA-C）、CD247及γ干擾素（interferon-gamma，IFN-γ）在內的9個基因直接參與腫瘤免疫逃逸。采用公共數據庫進一步評估CDK5與9個重要免疫相關基因之間的相關性，結果顯示CDK5表達與CD274、PD-L2及IFNG等免疫相關基因表達呈正相關（圖3）。對TCGA數據集中的CDK5表達水平與免疫細胞組分進行相關性分析發現，CDK5與活化記憶CD4T淋巴細胞和CD8T淋巴細胞均呈正相關（r=0.28、0.12），而與靜息記憶CD4T淋巴細胞和幼稚B淋巴細胞均呈負相關（r=-0.28、-0.24）。

圖3 不同數據集中CDK5與免疫相關基因的相關性

2.4 生存分析

收集GSE66229數據集中300例胃癌患者的測序數據及預后資料并進行生存分析。結果顯示，CDK5、CD274低表達的患者總生存率（overall survival，OS）均明顯低于高表達患者（CDK5：HR=0.52，95%CI=0.17～1.60，P＜0.01；CD274：HR=0.24，95%CI=0.07～0.80，P＜0.01）。（圖4）

圖4 GSE66229數據集中不同CDK5、CD274表達情況患者的生存曲線

2.5 CDK5表達與CD8+T淋巴細胞浸潤的相關性

采用免疫組織化學法檢測36例胃癌組織中CDK5和CD8的表達情況（圖5）。根據CDK5評分將患者分為CDK5高表達組（14例）和CDK5低表達組（22例），并評估兩組患者每高倍鏡視野CD8T淋巴細胞計數。結果顯示，CDK5高表達組患者CD8T淋巴細胞浸潤數目為（43.07±4.57），明顯多于CDK5低表達組的（24.27±2.64），差異有統計學意義（t=3.824，P＜0.01）。

圖5 胃癌組織中CDK5與CD8的表達情況（免疫組織化學染色，×200）

3 討論

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，在亞洲地區發病率極高。早期胃癌病情隱匿，確診時往往已處于晚期，故預后差，病死率高。盡管胃癌的綜合治療措施不斷完善，但仍未能獲得滿意效果。少數早期胃癌患者有可能通過手術切除而治愈，而進展期胃癌患者通過圍手術期化療及手術切除的綜合治療方案取得了一定療效。但仍有相當一部分進展期胃癌患者對化療藥物不敏感，削弱了手術帶來的生存獲益。盡管腫瘤治療手段不斷發展，但總體進展期胃癌的療效有限，預后較差，亟需新的治療手段。

CDK5基因位于7號染色體長臂3區6帶（7q36）上，其編碼分子量為33 kD的絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于CDK家族成員。最早關于CDK5功能的報道主要集中于神經元的有絲分裂中。隨著人們對CDK5功能的深入研究，發現除了參與神經細胞發育外，CDK5還參與多種腫瘤生物學行為，包括致癌作用及抑癌作用。

近年來，隨著腫瘤學、免疫學以及分子生物學等相關學科理論和技術的快速發展，以及對機體抗腫瘤免疫應答和腫瘤免疫逃逸機制的深入了解，腫瘤免疫治療的新策略已得到進一步的研究，腫瘤免疫療法引起了廣泛重視。本研究通過對TCGA及GEO公共數據庫進行通路富集分析，提示腫瘤免疫逃逸機制在胃癌的發生發展中發揮重要作用。PD-L1和PD-1是抗腫瘤免疫中的關鍵分子，大約30%的腫瘤對免疫檢測點抑制劑起作用。Sun等研究結果顯示，102例胃癌組織中PD-L1陽性表達率為42.2%，且PD-L1高表達的患者預后普遍較差。然而，Kim等研究結果顯示，PD-L1高表達患者預后比低表達患者更好，這與本研究采用芯片數據進行預后分析的結果一致。產生這些差異的原因可能與患者例數及腫瘤異質性有關。

CDK5在腫瘤的免疫逃逸中也起著至關重要的作用。Dorand等的研究發現，下調CDK5表達可以減少PD-L1表達從而遏制腫瘤免疫逃逸，提示CDK5可能成為腫瘤免疫治療的潛在靶點。本研究對公共數據集采用GSEA分析，發現免疫增強基因集及抗原提呈細胞相關基因集在CDK5高表達患者中顯著富集。富集的基因集中包含趨化因子家族成員（如CXCL9、CXCL10等）和腫瘤壞死因子受體超家族成員（如TNFRSF12A等），提示CDK5可能通過調控趨化因子或腫瘤壞死因子而參與免疫調控過程。為進一步評估胃癌中CDK5與腫瘤免疫逃逸的關系，本研究通過免疫組織化學法評估CDK5表達水平與CD8T淋巴細胞浸潤情況的關系，結果顯示CDK5高表達組患者的CD8T淋巴細胞浸潤數目明顯多于CDK5低表達組患者，提示高表達CDK5的胃癌組織可能引起機體更強的殺傷性T淋巴細胞浸潤。這可能是CDK5高表達患者預后通常較好的原因。

面對異質性較高且腫瘤微環境復雜的胃癌，基于免疫檢測點抑制劑的研究為胃癌治療提供了新策略。CDK5對PD-L1等免疫分子及殺傷性T淋巴細胞的影響及作用機制有待于更加深入的基礎研究證實。有理由相信，隨著相關基礎與臨床研究的逐漸成熟，免疫檢測點抑制劑將會被廣泛應用于晚期胃癌的治療中，為更多晚期胃癌患者帶來更好的生存獲益。