食管鱗癌組織中PD-1和PD-L1的表達及與患者預后的相關性研究

張群 蔡彭 楊妍 朱超莽 周士祥 張蕾 殷紅梅 李紅偉 李多杰

【摘要】 目的：探討PD-1和PD-L1在食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）腫瘤組織中的表達情況及與患者臨床病理特征和預后的相關性。方法：回顧性分析2012年1月-2016年12月于本院行食管癌根治性R0切除的139例Ⅲ期ESCC患者的病歷資料。通過免疫組織化學（IHC）法分析139例的ESCC腫瘤組織與其中50例的癌旁組織（距腫瘤切緣>5 cm）中的PD-1、PD-L1蛋白表達，研究其表達情況與患者臨床特征和預后的相關性。結果：ESCC腫瘤組織內PD-1、PD-L1蛋白陽性表達率均較癌旁組織高（18.7% vs 0，40.3% vs 22.0%，P<0.05）。不同PD-1、PD-L1表達情況患者年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、淋巴結（N）分期比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，PD-1陽性表達患者與PD-1陰性表達患者總生存率（overall survival rate，OS）及無病生存率（disease-free survival rate，DFS）比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;PD-L1陽性表達患者OS、DFS較PD-L1陰性表達患者均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。Cox回歸分析結果顯示，PD-L1蛋白表達是ESCC患者的獨立預后因子。結論：PD-1的表達與食管鱗癌患者的預后無明顯相關性，而PD-L1在食管鱗癌中的高表達與患者更差的預后相關。

【關鍵詞】 食管鱗癌 PD-1 PD-L1 預后

Study on Expression of PD-1 and PD-L1 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma and Its Correlation with Prognosis of Patients/ZHANG Qun， CAI Peng， YANG Yan， ZHU Chaomang， ZHOU Shixiang， ZHANG Lei， YIN Hongmei， LI Hongwei， LI Duojie. //Medical Innovation of China， 2021， 18（29）： 0-032

[Abstract] Objective： To analyze the expression of PD-1 and PD-L1 in esophageal squamous cell carcinoma （ESCC） and the relationship between the expressions of PD-1， PD-L1 and the clinicopathological characteristics and prognosis of the patients. Method： The data of 139 patients with ESCC in stage Ⅲ who underwent radical R0 resection of esophageal carcinoma in our hospital from January 2012 to December 2016 were retrospectively analyzed. Immunohistochemistry （IHC） was used to analyze 139 cases of ESCC and 50 cases of paracancerous tissues （>5 cm from the margin of tumor）， and the relationships between the expression of PD-1， PD-L1 and clinicopathological characteristics and prognosis of patients were analyzed. Result： The positive expression rates of PD-1 and PD-L1 proteins in ESCC tumor tissues were higher than those in para-cancer tissues （18.7% vs 0， 40.3% vs 22.0%， P<0.05）. There were no significant differences in age， gender， tumor site， degree of differentiation and lymph node （N） stage among patients with different PD-1 and PD-L1 expressions （P>0.05）. Kaplan-Meier survival analysis showed that there were no significant differences in overall survival rate （OS） and disease-free survival rate （DFS） between PD-1 positive patients and PD-1 negative patients （P>0.05）. OS and DFS in PD-L1 positive expression patients were significantly lower than those in PD-L1 negative expression patients， and the difference were statistically significant （P<0.05）. Cox regression analysis showed that PD-L1 protein expression was an independent prognostic factor in ESCC patients. Conclusion： The expression of PD-1 is not significantly correlated with the prognosis of patients with ESCC， while the high expression of PD-L1 in ESCC is correlated with the worse prognosis of patients.

[Key words] Esophageal squamous cell carcinoma PD-1 PD-L1 Prognosis

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College， Bengbu 233004， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.29.007

近年來，在全球范圍內食管癌的發病率逐年升高，其發病率、病死率分別居第4、6位[1-2]。在我國所有食管癌中，食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占其中的90%左右[3]。雖然同步放化療、免疫及靶向治療在食管癌的治療方面已取得了突破性進展，但其局部復發率和遠處轉移率仍然較高，文獻[4-5]報道患者5年生存率僅為30%左右。PD-1屬于免疫球蛋白超家族CD28成員，表達部位主要位于T細胞、DC細胞與B細胞的細胞膜。PD-L1的表達部位以激活態T細胞、成纖維細胞、B細胞、DC細胞、巨噬細胞與其他部分腫瘤細胞的細胞膜為主[6]。信號通路PD-1/PD-L1的激活會導致活化的T細胞衰竭，促進腫瘤細胞的免疫逃逸[7-9]。目前，已有多項研究表明相比于正常食管組織，ESCC患者中PD-1和PD-L1表達量增高，但這些差異表達和患者生存預后的相關性仍存在較大爭議。因此，本文旨在研究ESCC患者病理組織中PD-1/PD-L1蛋白的表達水平，研究其表達情況和患者臨床病理特征及預后的關聯性，以期為食管癌的治療提供新線索。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2012年1月-2016年12月于本院行食管癌根治性R0切除的139例Ⅲ期ESCC患者的病歷資料。（1）納入標準：①治療前行內鏡下組織活檢，經病理確診為ESCC;②經影像學、消化道鋇餐造影、超聲內鏡等檢查證實為Ⅲ期ESCC;③均為初次治療;④無其他系統（如心、肺、腎、腦等）嚴重合并癥，無手術禁忌證;⑤臨床病理和隨訪資料完備。（2）排除標準：①術前行新輔助放化療;②術前卡氏評分（KPS評分）<70分。同時選取其中50例的癌旁組織進行對照研究。收集患者年齡、性別、腫瘤分化級別、淋巴結轉移情況及腫瘤部位等數據。本研究涉及的所有組織標本均來自本院病理組織庫。

1.2 實驗試劑 兔抗PD-1/PD-L1單抗（劍橋Abcam公司，英國），多克隆過氧化物酶偶聯的抗兔IgG（中國福州麥心生物技術開發有限公司）。

1.3 PD-1/PD-L1表達的檢測

1.3.1 組織芯片 對腫瘤組織與其癌旁組織先進行蘇木精-伊紅（H&E）獨立染色，再通過福爾馬林固定，接著采取石蠟包埋（FFPE）處理，并由兩名病理學專家進行雙重檢查。用石蠟組織塊構建了139例病例和50個對照標本的組織微陣列。從每個標本的FFPE組織塊中取出直徑2 mm的區域。切下一系列4 μm厚的切片，并根據制造商的說明轉移到載玻片上進行免疫組化染色。

1.3.2 免疫組化 通過兔抗PD-1/PD-L1單抗開展IHC染色，用來對PD-1/PD-L1組織表達進行評估。將組織微陣列去石蠟并再水化，再對切片實施中和內源性過氧化物酶（PO）處理，最后通過山羊封閉血清完成封閉處理。隨后將樣品與PD-1/PD-L1抗體結合，和多克隆PO偶聯的抗兔IgG同時接受20 min孵育。最后，通過蘇木精對玻片實施復染處理。

1.3.3 免疫染色評估 在低倍鏡（×100）下檢查免疫組織化學結果，對于陽性染色的切片，以高放大倍數確定在每個選定視野中顯示高和低染色的腫瘤細胞的染色強度和比例。研究中使用的免疫反應評分模式（ISP）是強度類別和比例類別的組合[10]，強度類別等級為0分（藍紫色）、1分（淡黃色）、2分（棕黃色）和3分（棕褐色），比例類別等級為0分（小于1%），1分（1%～30%），2分（31%～60%）和3分（61%～100%）。通過將強度類別等級與比例類別等級相乘得出最終得分，分值0～9分，ISP<3分為陰性，ISP≥3分為陽性。兩名病理學專家對腫瘤樣本進行獨立雙盲審查并進行了評分，對于有爭議的標本進行討論直到達成共識。

1.4 隨訪 術后2年內，每3～6個月進行1次復查，2年后隨訪1次/年，直至死亡，將全因死亡（或疾病進展）作為隨訪終點事件，在隨訪時間上，中位值是29.5個月，結束隨訪的時間是2019年12月31日。

1.5 統計學處理 采用SPSS 26.0軟件對所得數據進行統計分析，通過字2檢驗或Fisher確切概率法分析PD-1、PD-L1蛋白的表達情況和患者臨床病理特征間的關聯性。通過Kaplan-Meier方法比較PD-1、PD-L1陰性表達與陽性表達兩組患者的OS和DFS差異。通過Cox比例風險模型篩選影響ESCC患者預后的相關因子。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESCC腫瘤組織中PD-1/PD-L1的表達情況 139例ESCC組織中，PD-1陽性26例（18.7%），陰性113例（81.3%）;PD-L1陽性56例（40.3%），陰性83例（59.7%）。50例癌旁組織，無PD-1陽性，陰性50例（100%）;PD-L1陽性11例（22.0%），陰性39例（78.0%）。相比于癌旁組織，PD-1、PD-L1在ESCC的細胞膜或細胞質（或兩者）中均過表達（P<0.05）。

2.2 PD-1、PD-L1與ESCC臨床病理特征的關系 不同PD-1、PD-L1表達情況患者年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、淋巴結（N）分期比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表1、2。

2.3 ESCC患者的預后多因素分析及PD-1、PD-L1蛋白表達的預后價值 通過Cox多因素模型分析影響患者OS、DFS的因素，結果顯示：淋巴結轉移狀態、PD-L1表達均是OS、DFS的獨立預后因子（P<0.05），見表3、4。PD-1的表達不是OS、DFS的獨立預后因子（P=0.518、0.602），見圖1。PD-L1陽性表達患者OS（中位OS為22.4個月）和DFS（中位DFS為18.7個月）較PD-L1陰性表達患者（中位OS為43.2個月，中位DFS為41.4個月）均顯著降低（P<0.05），見圖2。N0患者，PD-L1陽性表達患者OS（中位OS為28.7個月）與DFS（中位DFS為24.5個月）較PD-L1陰性表達患者均低（P<0.05）;N+患者，PD-L1陽性表達患者OS（中位OS為17.2個月）與DFS（中位DFS為16.6個月）與PD-L1陰性表達患者（中位OS為22.1個月，中位DFS為19.4個月）比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖3。

3 討論

PD-1和PD-L1的結合會傳遞機體免疫抑制相關信號，屬于抑制性的協同刺激分子，并抑制T淋巴細胞的活化，抑制T淋巴細胞殺傷靶細胞的功能，促進腫瘤增殖轉移[11-15]。但在ESCC中，患者腫瘤組織中的PD-1、PD-L1的表達與患者的臨床病理特征、預后的相關性仍然未知，雖然既往大量研究進行了探索，但各個研究之間報道的結果仍存在較大爭議。因此，本項研究通過回顧性分析139例ESCC術后標本，探討PD-1、PD-L1表達在局部可切除的Ⅲ期ESCC患者中的臨床意義及預后價值，以期為食管鱗狀細胞癌患者的預后提供預測指標。

本研究通過ISP法進行腫瘤組織中PD-1、PD-L1表達的評估，總體PD-1、PD-L1陽性表達率分別為18.7%、40.3%。統計分析結果顯示，不同PD-1、PD-L1表達情況患者年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、淋巴結（N）分期比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。但PD-L1高表達是影響ESCC患者OS、DFS的獨立預后因子（P<0.05）。相比于PD-L1陰性表達患者，PD-L1陽性患者OS與DFS均明顯降低（P<0.05）。提示PD-L1的表達與患者較差的預后有關。目前PD-L1過表達導致ESCC患者預后不良的機制仍不清楚，有研究表明PD-L1表達會加深腫瘤浸潤深度，從而促進局部進展[16-18]。李琦等[19]通過回顧性分析87例食管鱗癌患者PD-1/PD-L1表達與臨床特征的相關性，結果表明，PD-L1的表達與患者性別、年齡、吸煙、腫瘤位置、腫瘤形態、TNM分期均無明顯相關性，且其研究結果發現PD-L1高表達組1、2、3年生存率分別為32%、12%、12%，顯著低于PD-L1低表達組的59.8%、35.0%、28.7%，PD-L1高表達的患者死亡風險為PD-L1低表達的患者的1.587倍，是影響食患者生存預后的獨立影響因子。隋啟海等[20]收集325例行手術切除的食管癌患者的臨床資料并通過免疫組化的方法分析了腫瘤組織和部分癌旁組織中PD-1、PD-L的表達，結果表明，PD-1、PD-L1陽性表達率分別為12.0%、52.6%，PD-1、PD-L1的表達與患者性別、年齡、吸煙、腫瘤位置、腫瘤最大徑、淋巴結轉移均無明顯相關性，生存分析方面顯示，PD-1陰性表達患者與PD-1陽性表達患者總生存率比較，差異無統計學意義（P=0.500），但是在隨訪期內存活組的PD-L1陽性表達率明顯低于死亡組。以上結果與本研究是一致的，均提示腫瘤組織中PD-L1的過表達是ESCC切除術后患者生存的獨立預后因子。

此外，在本項研究中按淋巴結轉移狀態分類，N+患者，PD-L1陽性表達患者OS（中位OS為17.2個月）與DFS（中位DFS為16.6個月）與PD-L1陰性表達患者（中位OS為22.1個月，中位DFS為19.4個月）比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。分析原因可能是在癌癥的晚期階段，淋巴結轉移對患者預后的影響遠大于PD-L1的表達，提示針對不同淋巴結分期的ESCC患者，PD-L1表達對患者預后的預測價值存在局限性，顯示出對早期ESCC預后價值更高。

綜上，ESCC腫瘤組織中PD-1、PD-L1蛋白陽性表達率顯著增加，其表達和患者臨床病理特征之間無顯著關聯。但是PD-L1可作為ESCC患者OS、DFS的獨立預后因素，尤其對于N0的患者，PD-L1的高表達與患者更差的預后相關，但這一結論仍需要進一步的大規模，多中心的臨床試驗來驗證。

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（收稿日期：2021-08-23） （本文編輯：程旭然）