基于網絡藥理學的黑地黃丸治療腎性貧血機制探究

張益慶

（浙江省嘉興市南湖區余新中心醫院藥劑科 嘉興314009）

腎性貧血（RA）是由于各種因素造成腎臟促紅細胞生成素（EPO）產生不足或尿毒癥毒素積累干擾紅細胞生成和代謝導致的貧血，是慢性腎衰竭患者常見的并發癥之一。 目前西醫治療RA 主要是應用促紅細胞生成素及鐵劑，但因成本較高，給患者帶來巨大的經濟壓力，臨床應用受限。 黑地黃丸主要出自《素問病機氣宜保命集》，該集或為張元素所創，黑地黃丸主要由熟地、蒼術、干姜、大棗四味藥組成[1]?！侗Ｃ费缘溃骸爸侮柺㈥幪?，脾腎不足……面多青黃，而無常色，此藥益腎養血。 ”已有研究表明，黑地黃丸可以有效治療慢性腎衰竭所致RA，可提高RA患者的血紅蛋白濃度、紅細胞計數，對腎功能有一定保護作用[2]，然而目前對黑地黃丸治療RA 的機制研究相對較少。 網絡藥理學是在網絡生物和多向藥理學的基礎上，針對中藥多成分、多靶點、多途徑等特點，提出研究中藥復方或單味藥臨床作用機制的新方法、新策略，本研究運用網絡藥理學方法探究黑地黃丸治療慢腎衰導致的RA 的作用機制。 現報道如下：

1 資料與方法

1.1 黑地黃丸藥物成分收集與篩選 基于藥代動力學參數：吸收、分布、代謝、排泄（ADME），分別以“熟地”“蒼術”“干姜”“大棗”為關鍵詞在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺數據庫（TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php） 按口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 條件篩選中藥成分。

1.2 黑地黃丸有效成分靶點預測 從TCMSP 中查詢黑地黃丸有效成分對應的靶標蛋白， 并導入Unitprot 數據庫（http://www.Unitprot.org/）查詢靶標蛋白的基因名稱，同時進行基因標準化處理。

1.3 RA （Renal anemia） 疾病的靶點 預 測 在OMIM 數據庫（http://www.omim.org/）、PharmGkb 數據庫（https://www.pharmgkb.org/）、GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/） 以關鍵詞“Renal Anemia”進行檢索，對RA 相關的靶點基因進行收集， 并導入Uniprot 數據庫進行基因名標準化處理后歸納整理。

1.4 蛋白互作網絡圖（PPI）的構建與分析 先將黑地黃丸有效成分作用靶點進行去重， 再與RA 疾病靶點組建“成分-疾病”靶點數據庫，取兩者交集，組成“成分-疾病”映射文件，即尋找成分與疾病共有的靶點。 運用交集出的共有靶點與化合物成分，通過STRING 數據庫建立“黑地黃丸-RA 靶點”的PPI網絡。 運用Cytoscape 軟件對“有效成分-RA”靶點蛋白互作網絡進行節點度（dregree=8.4）值篩選，得到“有效成分-RA”靶點核心網絡圖。

1.5 GO 生物功能富集分析 將上述作用靶點輸入到DAVID 6.8 數據庫，進行生物功能富集分析。 再將作用靶點復制到基因搜索列表，對應基因標示符選擇“OFFCIAL-GENE-SYMBOL”物種及背景設定為人，然后進行分析獲得結果。

1.6 KEGG 代謝通路富集分析 利用DAVID6.8數據庫對相應靶點進行代謝通路分析。 物種及背景設定為人，選擇KEGG-PATHWAY，并以“P＜0.05”進行篩選，最終得到分析結果。

2 結果

2.1 黑地黃丸的有效成分收集和篩選 通過運用TCMSP 數據庫，以“熟地”“蒼術”“干姜”“大棗”為關鍵詞進行成分搜索， 共得到黑地黃丸有效成分406個，其中熟地76 個，蒼術49 個，干姜148 個，大棗133 個；基于藥代動力學參數（ADME），按照口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 條件，進行有效性篩選，同時查閱文獻進行補充，共得到黑地黃丸有效成分45 個，其中熟地2 個，蒼術9 個，干姜5 個，大棗29 個，由結果得知黑地黃丸主要包含甾醇類、生物堿、苷類、萜類和黃酮類等成分具有良好的OB 和DL 值，如豆甾醇、槲皮素、葡萄糖苷-qt、繡線菊堿A 等。 見表1。

表1 黑地黃丸有效成分

2.2 黑地黃丸有效成分靶點的預測及與成分-靶點網絡圖的構建 運用TCMSP 網絡數據庫， 將黑地黃丸45 個有效成分在數據庫內進行檢索，獲取有效成分的對應靶點，共725 個。 并將靶點導入Unitprot數據庫（http://www.Unitprot.org/）進行基因名標準化處理，再通過Cytoscape3.7.2 軟件構建“黑地黃丸-有效成分-靶點”網絡圖，該圖由183 個節點組成，紅色“V”代表中藥名，綠色圓形代表黑地黃丸有效成分，粉紅色正方形代表有效成分所對應的靶點，節點與節點之間的邊表示藥物成分與成分靶點之間的相互作用關系，平均自由度8.4，最大自由度104，最小自由度1。 見圖1。

圖1 黑地黃丸有效成分-靶點網絡圖

2.3 疾病靶點信息的收集 在OMIM、PharmGkb、GeneCards 數據庫中以“Renal Anemia”“RA”為關鍵詞進行數據搜索整理， 其中GeneCards 數據庫以“Relevance score＞30”進行篩選，共尋找到靶點基因400 個，其中OMIM（200 個）、PharmGkb（13 個）、GeneCards（187 個）；將以上數據庫合并整理后并導入Uniprot 數據庫進行基因標準化處理， 再以Uniprot ID 為標準，用EXCEL 表格的“刪除重復值”功能，對數據進行去重，最終篩選得到疾病靶點315個；并運用Cytoscape3.7.2 軟件構建“疾病-靶點”網絡圖。 見圖2。

圖2 RA-疾病-靶點網絡圖

2.4 靶點相互作用網絡構建與分析 利用EXCEL表格篩選功能， 將315 個RA 疾病靶點和725 個藥物有效成分靶點進行合并，取兩者交集，得到藥物成分和疾病的共有靶點17 個，見表2。將這17 個靶點導入STRING 數據庫建立“黑地黃丸-RA 靶點”的PPI 蛋白互作網絡，見圖3，共得到17 個節點，69 條邊，平均節點度為8.12；將該結果以STV 格式導出，再通過Cytoscape3.7.2 軟件對該網絡進行拓撲分析，以“＞平均Degree 值8.11”為篩選標準，得到12個核心節點，它們分別是：白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）、干擾素γ（IFNG）、前表皮生長因子（EGF）、血紅素加氧酶1（HMOX1）、細胞腫瘤抗原p53（TP53）、白介素-2（IL-2）、凝血酶原（F2）、 糖皮質激素受體（NR3C1）、 一氧化氮合酶（NOS3），具體見圖4。說明該12 個靶點在整個網絡中占據重要地位， 提示這些靶點可能是黑地黃丸發揮治療作用的關鍵所在。

表2 藥物-疾病共有靶點

圖3 PPI 蛋白互作圖

圖4 核心靶點網絡圖

2.5 GO生物功能富集分析 運用DAVID6.8 數據庫對17 個潛在作用靶點進行生物功能富集分析，確定了129 個GO 條目。 其中生物學過程（BP）條目最多，有107 個：主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、細胞增殖的正調控、基因表達的正調控、一氧化氮生物合成過程的正調控等107 個生物過程；分子功能（MF）相關條目有14 個：主要涉及蛋白質結合、生長因子活性、細胞因子活性、酶結合等分子功能；細胞組成（CC）相關條目有8 個，主要涉及細胞外空間、細胞外區域、細胞質、質膜等；以靶點富集數目多少為原則，篩選出前20 條GO 生物功能富集結果。結果提示：黑地黃丸治療RA 可能與蛋白質結合、細胞外空間、細胞質、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控等生物功能有關。 見表3。

表3 前20 條GO 生物功能分析

2.6 KEGG 代謝通路富集分析 運用DAVID6.8數據庫對17 個潛在作用靶點進行代謝通路富集分析，共獲得39 條通路。以P＜0.05 為條件篩選，按富集基因數降序原則排序， 得到前20 條KEGG 代謝通路， 其中富集靶點數目前三位的通路主要包括：HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥的途徑（Pathways in cancer）。 以上數據顯示，黑地黃丸的有效成分可能通過作用于這些代謝通路發揮其治療RA 的潛在作用。 見表4。

表4 前20 條KEGG 代謝通路富集分析

3 討論

RA 在中醫學中并無具體病名， 但近代中醫醫家學者將其歸屬于“腎勞、虛勞、血枯”等范疇。 病因多為先天不足、后天失養、外感邪氣、內傷勞倦、情志久病、房勞傷腎等有關。 腎病后期五臟俱虛，濁邪壅滯脾胃，使脾胃受納水谷精微失調，氣血化生無源，故氣血虧虛；精可化血，血可養精，腎病日久，腎精虧虛，則血源不足，使貧血加重；故脾腎虧虛為該病的基本病機。

黑地黃丸在治療慢性腎臟病及其并發癥、 改善腎功能方面具有良好效果。 中藥具有多成分、 多靶點、多途徑的特點，本研究運用網絡藥力學方法探討黑地黃丸治療RA 的物質基礎和分子作用機制。 研究結果顯示， 黑地黃丸與RA 共有17 個公共靶點，經過PPI 網絡分析和拓撲分析后共得到12 個核心靶點 ：IL-6、TNF、VEGFA、EGFR、IFNG、EGF、HMOX1、TP53、IL-2、F2、NR3C1、NOS3，提示該藥治療RA 具有多組分、 多靶點的特點。 現代醫學認為RA 多屬慢性病貧血（ACD），可能與鐵吸收異常、巨噬細胞釋放鐵障礙、EPO 表達異常等有關。 有研究顯示IL-6 通過炎性機制反應，可引起鐵代謝紊亂導致貧血，從而參與造血調控[3]；TNF-琢是造血負調控因子，影響鐵代謝，可以抑制紅系造血功能[4]；林雪峰等[5]分析發現免疫及炎癥反應所介導的TNF-琢和IL-6 可能通過影響鐵代謝和EPO 生成抑制、EPO 的反應鈍化等途徑參與ACD 的發生發展；王歡等[6]研究發現貧血情況下VEGFA 生成增多， 會促進組織血管生成，從而代償性增加氧氣利用率；HMOX1 可分解血紅素產生鐵，是鐵在體內重復利用的重要來源，在鐵代謝中發揮關鍵作用；因此可以推測其調節障礙會導致鐵的缺乏，從而引起貧血；EGF 可能與骨髓血管生成和造血有關[7]；眾多研究發現細胞毒性T淋巴細胞可分泌造血負調控因子IFN-γ，具有較強的造血抑制活性[8]；NOS 作為合成一氧化氮（NO）的關鍵酶，也是造血負調控因子，INF-γ 還能強烈誘導一氧化氮合酶表達，通過促進NO 合成、釋放來抑制造血功能；還有研究發現貧血與免疫機制密切相關[9]，IL-2 不僅可反映T 細胞的功能，并且IL-2 異常與再生障礙性貧血（AA）的造血抑制有關。 由KEGG 代謝通路富集分析發現靶點蛋白富集在HIF-1 信號通路上數目最多， 預測黑地黃丸治療RA 可能主要通過該通路發揮作用；HIF-1（低氧誘導因子）通過模擬機體缺氧，刺激機體產生內源性EPO，可提高紅細胞對鐵的利用性， 從而實現治療RA 的目的[10]；PI3K-Akt 信號通路參與調節造血干細胞的生長、增殖和存活等重要生物過程，過度激活該信號通路會造成造血干細胞的耗竭[11]；癌癥與炎性反應密切相關， 富集在癌癥通路上的EGFR，IL-6，VEGFA，TP53，EGF 等可能通過炎癥反應、細胞增殖與分化、氧化應激等生物過程參與對RA 的治療； 于生友等[12]研究發現PI3K/Akt 信號通路在腎小球足細胞凋亡中發揮保護腎小球足細胞作用； 推測黑地黃丸可以通過利用以上多種通路的調控保護腎功能， 改善尿毒癥誘導的紅細胞生成抑制、鐵利用障礙[13]等。

綜上所述，黑地黃丸治療RA 具有多靶點、多通路、多成分特點，同一靶點可通過多個信號通路和生物過程發揮作用，其機制較為復雜。本研究明確了黑地黃丸治療RA 的物質成分基礎及潛在作用靶點，并通過富集分析闡釋了黑地黃丸作用的信號通路和分子機制， 為RA 的臨床治療和實驗研究提供了新方法、新思路。