蒼術內酯II對骨關節炎大鼠軟骨損傷、血清炎癥因子和氧化應激的調節作用及機制研究*

楊光，惠越，陳奎，王偉，饒楚炳

1.湖北醫藥學院附屬東風醫院，湖北 十堰 442000； 2.十堰市太和醫院，湖北 十堰 442000

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是常見于老年人群體中的一種慢性退行性關節疾病，其發病率隨年齡的增長而升高，主要的病理改變表現為關節軟骨缺損及軟骨下骨質增生[1-2]。目前OA的發病機制依然不夠清楚，但氧化應激、炎癥因子、維生素D、肥胖等因素都被證明是OA的危險因素[3-4]，其中炎性因子誘發的軟骨細胞外基質的過度降解和軟骨退化被認為是OA的主要因素[5]。蒼術內酯II(atractylenolide II，AT-II)是從中藥白術中分離的1種倍半萜烯，具有很好的抗炎、抗癌[6-8]及口服生物利用度，常用于治療黑色素瘤[9]。目前鮮有AT-II用于OA治療的相關研究。本研究通過木瓜蛋白酶制成OA大鼠模型，并用不同濃度AT-II處理3周后，觀察AT-II對各組大鼠軟骨損傷、細胞凋亡、炎癥反應及氧化應激等過程的調控機制，以期為AT-II治療OA提供相關理論依據。

1 材料

1.1 動物SPF級8～10周齡雄性SD大鼠30只，體質量260～280 g，購于武漢大學動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(鄂)2019-0004，飼養于十堰市人民醫院SPF級飼養環境，許可證號：SYXK(鄂)2017-0098，培育室溫度20～25 ℃，濕度保持在65%～70%，進行人工光照(12 h/晝、12 h/夜)。

1.2 藥品與試劑蒼術內酯II(中國食品藥品檢定研究院，貨號180508)；兔抗MMP-13、Coll-II、Aggrecan、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、p-P65、P65、P-STAT3、STAT3、GAPDH多克隆抗體(美國Abcam公司，貨號：180622、180509、180429、180713、180613、180521、180729、180524、180603、180512、180719、180515)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(monochrome display adapter，MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司，貨號分別為：180118、180213、180321、180312)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)試劑盒(上海高創化學科技有限公司，貨號分別為：170428、170524、170324、170329)；總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司，貨號分別為：ZP401、ZR102、ZF201)；MMP-13、Coll-II、Aggrecan及β-Actin引物由上海捷瑞公司合成。

1.3 儀器小動物手術器械(北京眾實嘉合生物科技有限公司)；JT-P型石蠟包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；RM2235型病理切片機(德國徠卡公司)；KD-P型組織攤片機(金華市科迪儀器設備有限公司)；Olympus型光學顯微鏡(上海普赫光電科技有限公司)；實時熒光定量PCR儀(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 動物模型制備及分組給藥構建早期膝骨性關節炎大鼠模型[10]。將30只SD大鼠隨機分為5組，腹腔注射10%的水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉，在第1、3、5 天給其中4組大鼠左膝關節腔內注射0.03 mol·L-1的L-半胱氨酸和5%(w/v)木瓜蛋白酶混合液，另外1組作為對照組注射等量生理鹽水，注射后傷口用碘伏消毒，之后放于籠中，自由活動，密切關注傷口感染及其他并發癥情況。注射生理鹽水的大鼠作為對照組，其余4組分為模型組，AT-II(低、中、高劑量)組，各組大鼠均在造模后 48 h 開始給藥。AT-II低、中、高劑量組分別進行腹腔注射5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1的 AT-II 溶液，對照組和模型組腹腔注射同等體積的生理鹽水，連續給藥3周，每天1次。

2.2 相關指標檢測

2.2.1 染色檢查大鼠軟骨損傷情況將大鼠麻醉于冰盒上取膝關節脛骨內側脛骨平臺后1/2處，用手術刀剪成0.5 cm×0.2 cm×0.5 cm的小骨塊，漂洗后用4%的多聚甲醛固定24 h，流水沖洗1 h用10%EDTA脫鈣液脫鈣2個月，行常規標本脫水，浸蠟，包埋制成石蠟塊，連續切片為5 μm厚切片，進行HE、番紅氧、Masson染色后，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察軟骨損傷情況。

2.2.2 qRT-PCR檢測按照總RNA提取試劑盒說明書上操作步驟提取各組大鼠軟骨組織中的總RNA，提取后用紫外分光光度計檢驗OD[(A260/A280)=1.8～2.0]值，并用凝膠電泳檢測RNA的完整性。按照反轉錄試劑盒說明書進行 cDNA 的合成。反轉錄體系(10μL)：2×miRNA反應混合液 5 μL，0.1%BSA 1 μL，miRNA PrimeScript?RT酶混合物1 μL，總RNA 0.5 μL，去RNA酶ddH2O 2.5 μL。反應條件設置：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 30 min。PCR體系10 μL：SYBR?Prmix Ex Tap II(2×)5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。詳細操作見試劑盒說明書。PCR反應參數設置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反應進行40個循環。溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每個樣孔設置3個復孔。用2-△△Ct法計算mRNA的表達量。

2.2.3 Western blot檢測提取大鼠軟骨組織中的總蛋白，采用Bradford調整各組蛋白濃度一致，經SDS-PAGE凝膠電泳、電轉膜至甲醛處理過預處理過的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人MMP-13、Coll-II、Aggrecan、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、P-P65、P65、P-STAT3、STAT3、GAPDH一抗(1500)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標記的二抗(1500)孵育1 h，TBST漂洗 40 min，ECL發光液將PVD膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Image System軟件分析各組條帶灰度值，依據相對灰度值進行統計學分析。

2.2.4 血清中MDA、LDH、SOD、GSH水平的檢測取大鼠外周血，離心后取血清，檢測MDA、LDH、SOD、GSH水平。

2.2.5 血清中炎性細胞因子水平的檢測取大鼠外周血，離心后取血清，利用EILSA法檢測IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-ɑ水平。

3 結果

3.1 AT-II改善模型大鼠軟骨損傷情況HE染色顯示，模型組大鼠關節軟骨面骨裂隙形成，軟骨面破壞達到移行層、輻射層、鈣化層，且關節淺層表面逐漸缺失，深層細胞增生紊亂，用不同濃度AT-II處理后，關節軟骨表面逐漸變得光滑，細胞增生情況減少，細胞排列變得較為規整，且潮線破壞程度降低。番紅氧染色顯示，模型組大鼠軟骨出現大量的缺損及裂隙，細胞數減少，潮線消失，番紅氧染色重度或完全失染，AT-II低劑量組軟骨表面有裂隙生成，深達中間層，軟骨細胞增多，同源細胞群增多，番紅氧染色中重度失染，AT-II中劑量組軟骨表明裂隙較少，表面平整，番紅氧染色輕中度失染；AT-II高劑量組軟骨表明無明顯裂隙，表面平整，番紅氧染色均勻，無失染情況。Masson染色顯示，模型組大鼠軟骨組織結構破壞明顯，有大量炎性細胞浸潤及紅細胞滲出，軟骨細胞間隔增寬，AT-II處理后能夠顯著減緩模型引起的軟骨組織損傷，并減少了炎性細胞的浸潤及紅細胞的滲出，軟骨細胞間的間隔變窄。見圖1。

圖1 HE、番紅氧、Masson染色觀察各組大鼠軟骨損傷情況

3.2 AT-II抑制OA大鼠軟骨組織細胞外基質降解qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠軟骨組織中MMP-13mRNA相對表達顯著升高，CollagenIImRNA、AggrecanmRNA相對表達顯著降低(P<0.01)，與模型組相比，AT-II低、中、高組大鼠軟骨組織中MMP-13mRNA相對表達顯著降低，CollagenIImRNA、AggrecanmRNA相對表達顯著升高(P<0.01)。見圖2A。

Western Blot檢測結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠軟骨組織中MMP-13蛋白表達顯著升高，Collagen II、Aggrecan蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，AT-II低、中、高組大鼠軟骨組織中MMP-13蛋白表達顯著降低，Collagen II、Aggrecan 蛋白表達顯著升高(P<0.01)。見圖2B。

注：A：各組大鼠軟骨組織中MMP-13 mRNA、Collagen II mRNA、Aggrecan mRNA相對表達情況；B：各組大鼠軟骨組織中MMP-13、Collagen II、Aggrecan蛋白表達情況。與對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖2 AT-II對模型大鼠軟骨組織中MMP-13、Collagen II、Aggrecan表達的影響

3.3 AT-II抑制模型大鼠軟骨組織細胞凋亡Western Blot檢測結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠軟骨組織中Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，AT-II低、中、高組大鼠軟骨組織中Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.01)。見圖3。

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05圖3 AT-II對大鼠軟骨組織中細胞凋亡蛋白表達的影響

3.4 AT-II降低模型大鼠氧化應激反應與對照組相比，模型組大鼠外周血中SOD、GSH水平顯著降低，MDA、LDH水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，AT-II低、中、高組大鼠外周血中SOD、GSH水平顯著升高，MDA、LDH水平顯著降低(P<0.01)。見圖4。

注：與對照組相比，*P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖4 AT-II對大鼠血清中SOD、GSH、MDA、LDH水平的影響

3.5 AT-II降低模型大鼠炎癥反應與對照組相比，模型組大鼠外周血中IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高，IL-10水平顯著降低(P<0.01)，與模型組相比，AT-II低、中、高組大鼠外周血中IL-6、IL-β、TNF-α水平顯著降低，IL-10水平顯著升高(P<0.01)。見圖5。

注：與對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖5 AT-II對大鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β水平的影響

3.6 AT-II抑制P65和STAT3蛋白磷酸化Western blot結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠軟骨組織中p-P65/P65、p-STAT3/STAT3水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，AT-II低、中、高組大鼠軟骨組織中P-P65/P65、P-STAT3/STAT3水平明顯降低(P<0.05)。見圖6。

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05圖6 AT-II對模型大鼠軟骨組織中P-P65/P65、P-STAT3/STAT3的影響

4 討論

現有研究表明，OA是在機械性及生物性因素的相互作用下，導致關節軟骨細胞、細胞外基質及軟骨下骨降解及合成紊亂進而引起的一種退行性疾病[11]。關節軟骨是由99%的軟骨基質和1%的軟骨細胞組成的。因此，軟骨發揮正常的生理功能與其內組分的形態及代謝穩定關系密切[12]。Collagen II、Aggrecan是細胞外基質(ECM)的主要成分，當軟骨組織遭受破壞時，會導致ECM異常降解，同時ECM的合成也減少，軟骨組織退化加重，從而導致OA的發生[13-14]。MMP-13作為基質金屬蛋白酶家族的重要成員，能顯著降解EMC中的Collagen II、Aggrecan[15]。本研究結果顯示，軟骨組織染色發現，木瓜蛋白酶處理大鼠后，軟骨細胞損傷嚴重，大量炎性細胞及紅細胞滲出，骨裂隙明顯，用不同濃度 AT-II 處理后發現軟骨組織的損傷得到了不同程度的改善，且改善程度呈AT-II濃度依賴；還發現模型組大鼠軟骨組織中Collagen II、Aggrecan表達明顯降低，MMP-13表達顯著升高，而不同濃度 AT-II 處理后，Collagen II、Aggrecan表達升高而MMP-13表達降低，表明AT-II處理能夠抑制軟骨組織EMC異常降解，促進EMC組分的合成，進而緩解OA的關節損傷。秦夢等[16]研究結果表明，MMP-13表達下調、Collagen II表達上調是EMC降解破壞改善的表現，本研究與前人結果一致，表明AT-II能夠有效緩解EMC降解破壞引起的軟骨組織損傷。

近年來有研究者發現，OA的嚴重程度與軟骨組織細胞凋亡數量之間存在顯著的相關性[17]。Caspase-3、Caspase-9作為細胞凋亡過程中發揮著重要作用的Caspase家族成員，是介導細胞凋亡的執行者，其表達水平上調會誘導細胞凋亡[18]。Bcl-2和Bax蛋白在調控細胞凋亡的過程中發揮著重要的作用，兩者相互拮抗[19-20]。本研究結果顯示，模型組大鼠軟骨組織中Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白的表達顯著升高，而Bcl-2的表達顯著降低，而不同濃度AT-II處理后，Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達顯著降低，而Bcl-2的表達顯著升高，表明AT-II處理后能夠顯著抑制軟骨組織中細胞凋亡，且濃度越高對細胞凋亡的抑制越強烈。

目前研究表明，炎癥反應和氧化應激反應在OA的發生及發展中都發揮著非常重要的作用[21-22]。炎癥細胞因子除能夠影響軟骨細胞的相關代謝之外，還可通過逐級放大級聯反應，促使軟骨細胞異常肥大，使軟骨細胞外基質的分泌受到抑制，同時還會降解細胞外基質[23-24]。IL-1β是最為常見的一種促炎癥因子，它除了自身可以促進軟骨細胞炎癥反應外，還可通過促進軟骨細胞分泌NO、TNF-ɑ、IL-6等炎性因子，進一步激活其他炎癥反應信號通路，促進軟骨細胞外基質的降解[25]。正常情況下，機體內的活性氧物質會在SOD、GSH等的作用下保持動態平衡，當SOD水平升高功能受到損傷時，ROS水平也升高，會攻擊線粒體DNA、酶、生物膜、蛋白質、核酸等物質，引起蛋白質變性、基因突變及脂質過氧化，導致膜結構及功能損傷[26]；MDA就是脂質過氧化的最終產物之一，其水平標志著氧化應激狀態[27]。本研究結果發現，AT-II處理能提高模型大鼠血清中SOD、GSH、IL-10水平，降低MDA、LDH、IL-1β、IL-6、TNF-α水平，表明 AT-II 處理能夠顯著改善模型大鼠的炎癥反應及氧化應激反應。

NF-κB信號通路途徑在機體內炎癥、細胞凋亡、免疫等過程中發揮著重要調控作用，很多藥物的抗炎作用都是通過抑制NF-κB信號通路來完成的[28-29]。JAK2/STAT3信號通路途徑對多種疾病的發生發展都起到了重要的調控作用，STAT3的活化能夠有效控制炎癥反應并修復氧化損傷[30]。本研究結果顯示，AT-II處理后，p-P65、p-STAT3蛋白表達降低，表明AT-II可能是通過抑制 NF-κB 和STAT3相關途徑來調控大鼠的氧化應激及炎癥反應過程。

綜上所述，AT-II可能是通過抑制NF-κB和STAT3信號轉導途徑，抑制細胞凋亡蛋白表達，促進抗凋亡細胞表達，抑制軟骨細胞凋亡；同時促進SOD、GSH的合成，恢復體內氧化還原平衡，減少對脂膜的攻擊，降低氧化產物MDA、LDH的水平；提高抗炎癥細胞因子IL-10水平，降低促炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的水平，緩解軟骨組織中的炎癥反應，從而減輕大鼠軟骨損傷。本研究初步揭示了 AT-II 治療OA的相關機制，但還需要繼續深入研究，為AT-II臨床使用提供更有力的理論依據。