夏枯草通過調控OPG/RANK/RANKL信號通路對骨肉瘤小鼠的抑瘤作用研究*

杜兵強，張偉霞，張連平

鄭州市第六人民醫院，河南 鄭州 450000

骨肉瘤是一種原發性骨腫瘤，青少年是其高發人群，發病率高，每萬人中有2～3例發病，由于其惡性程度高、復發率和病死率高，給患者帶來巨大威脅[1]。目前，手術輔助化療是骨肉瘤主要治療手段，患者預后保肢率及存活率均得到有效提高，但仍有部分患者治療效果不佳，出現骨轉移，預后較差[2]。因此，探索新的、有效治療骨肉瘤的藥物對改善患者預后、延長生存期有重要意義。隨著對惡性腫瘤研究的不斷深入，中藥在抗腫瘤及輔助治療腫瘤方面愈來愈受到人們重視。唇形科植物夏枯草最早記載于《神農本草經》，具有清肝名目、消腫、軟堅散結的功效[3]。關于其抗乳腺癌[4-5]、肝癌[6-7]效果已得到證實，但其對骨肉瘤的抑制作用鮮有研究。鑒于此，本研究通過建立骨肉瘤S180荷瘤小鼠，探討夏枯草是否能通過調控骨代謝經典代謝通路OPG/RANK/RANKL發揮抑瘤作用。

1 材料

1.1 動物和細胞系60只SPF級健康昆明小鼠，雌雄各半，6周齡，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2018-0004，飼養于12 h/12 h明暗交替、23～25 ℃、濕度50%～60%的條件下，倫理學批號20200701；S180骨肉瘤細胞株，購自中國科學院上海生命科學研究院，貨號：BS-C64870058。

1.2 藥物和試劑夏枯草干燥果穗購自長沙高橋藥材市場，經中國醫學科學院藥物植物研究所鑒定為唇形科夏枯草屬植物夏枯草(PrunellavulgarisL)，粉碎加入10倍蒸餾水，加熱回流提取4次，合并提取液并進行減壓濃縮、冷凍干燥后備用。環磷酰胺(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：160613)；吖啶橙溴乙錠(AO/EB)雙熒光染色試劑盒(上海遠慕生物科技有限公司，貨號：YM-S1403)；逆轉錄試劑盒(蘇州宇恒生物科技有限公司，貨號：R2028)；BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Bio-rad公司，貨號：LIT33)；兔抗人OPG、RANK、RANKL抗體(美國Abcam公司，貨號分別為：ab73400、ab193713、ab216484)；二抗(美國Abcam，貨號：ab203061)。

1.3 儀器TCS SP8 X型激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；Synergy H4 Hybrid酶標儀(美國Bio-Tek公司)；9700實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；ChemiDoc XRS型化學發光成像分析系統(Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 骨肉瘤S180荷瘤小鼠模型建立及分組干預收集小鼠腹腔內傳代6 d的S180腹水，生理鹽水洗滌、離心和重懸后，調整細胞密度為2×107mL-1備用；所有小鼠均適應性飼養7 d后，隨機取10只為對照組，剩余50只均于小鼠右側腋窩皮下接種 0.1 mL 的S180腹腔傳代細胞[8]，對照組接種 0.1 mL 生理鹽水，同條件繼續飼養，監測腫瘤直徑至1 cm時，將荷瘤小鼠隨機分為5組，即模型組、夏枯草低劑量組、夏枯草高劑量組、化療組、夏枯草聯合化療組，每組各10只。夏枯草低、高劑量組分別灌胃1 g·kg-1、2 g·kg-1的夏枯草生理鹽水，模型組和對照組灌胃生理鹽水；化療組腹腔注射 0.03 g·kg-1的環磷酰胺，隔日1次，夏枯草聯合化療組灌胃 2 g·kg-1的夏枯草生理鹽水加隔日腹腔注射0.03 g·kg-1的環磷酰胺，各組均干預14 d。

2.2 觀察指標

2.2.1 小鼠生存狀態觀察及腫瘤大小測量給藥期間觀察各組小鼠生存狀態，于末次給藥2 h處死小鼠，迅速剝離瘤塊，去除雜質，生理鹽水洗凈擦干，稱取瘤重，計算抑瘤率。

2.2.2 各組腫瘤病理組織學變化取部分瘤組織，置于4%的多聚甲醛中固定，經乙醇梯度脫水，常規石蠟包埋，制作厚度為4 μm的連續切片；切片經脫蠟、水化，進行常規蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片后置于光學顯微鏡下觀察腫瘤病理變化。

2.2.3 各組腫瘤細胞凋亡率比較取部分瘤組織制成單細胞懸液，進行吖啶橙溴乙錠(AO/EB)染色，熒光顯微鏡掃描拍照觀察：呈亮綠色熒光，細胞質均勻為正常細胞；呈綠色熒光，細胞體積縮小或變性為早期凋亡細胞；呈淺黃色、棕色熒光，細胞形態改變為晚期凋亡細胞；呈橘紅色固縮細胞為死細胞；每張照片隨機選取4個視野，計數各種細胞數目。

2.2.4 OPG、RANK、RANKL基因表達檢測取部分瘤組織，加入液氮研磨，Trizol一步法提取細胞內總RNA，酶標儀測定RNA濃度和純度，采用逆轉錄試劑盒合成互補鏈cDNA；采用SYBR GREEN試劑盒進行實時熒光定量PCR，按照說明書設定反應體系，反應條件：95 ℃預變性60 s；95 ℃變性 15 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸60 s，重復42個循環。以β-actin為內參基因，2-△△CT為待測基因的相對表達強度，重復3次取Ct平均值，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.2.5 OPG、RANK、RANKL蛋白表達檢測取約75 mg部分瘤組織，液氮研磨，然后加入0.5 mL細胞裂解液，10 000 r·min-1離心5 min(離心半徑 12 cm)，收集上清進行蛋白定量。取20 μg待測樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉1 h至硝酸纖維素膜，加入封閉液搖床孵育2 h，加入稀釋一抗，4 ℃搖床過夜，加入稀釋二抗，常溫孵育1 h，ECL化學發光試劑盒曝光、顯影，應用凝膠成像系統掃描各蛋白條帶灰度值，以待測蛋白與內參灰度值比值作為相對表達量。

3 結果

3.1 小鼠一般情況對照組小鼠均無異常，建模期間小鼠出現喜臥、反應遲鈍、進食量下降、毛色暗淡等現象，且隨著時間的延長逐漸加重；夏枯草組、化療組及夏枯草聯合化療組小鼠干預期間，上述一般狀況和精神狀態均有所好轉，其中夏枯草聯合化療組改善最為明顯，模型組情況更加嚴重，干預14 d內各組均無死亡。

3.2 小鼠腫瘤組織的抑瘤率與模型組比較，其余4組瘤質量均明顯減輕(P<0.05)；與夏枯草低劑量組比較，夏枯草高劑量組、化療組、夏枯草聯合化療組瘤質量明顯減輕、抑瘤率明顯較高(P<0.05)；與夏枯草高劑量組比較，化療組瘤質量、抑瘤率無明顯差異(P>0.05)，夏枯草聯合化療組瘤質量明顯減輕、抑瘤率明顯較高(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠抑瘤率比較

3.3 小鼠腫瘤的病理組織學模型組腫瘤細胞排列緊密、細胞核大而深染，細胞膜完整；夏枯草低劑量組細胞核染色稍淺，部分呈現細胞核分裂、空泡或細胞膜輪廓不清現象；夏枯草高劑量組和化療組上述狀況進一步加重，出現細胞核固縮、胞漿增多現象，核分裂明顯，壞死區域擴大；夏枯草聯合化療組呈現大面積淺色壞死區，僅有少量細胞結構完整。見圖1。

注：A：模型組；B：夏枯草低劑量組；C：夏枯草高劑量組；D：化療組；E：夏枯草聯合化療組圖1 腫瘤病理組織學觀察(×200)

3.4 小鼠腫瘤細胞的凋亡率與模型組比較，其余4組凋亡率均明顯升高(P<0.05)；與夏枯草低劑量組比較，夏枯草高劑量組、化療組、夏枯草聯合化療組凋亡率均明顯升高(P<0.05)；與夏枯草高劑量組比較，化療組無明顯差異(P>0.05)，夏枯草聯合化療組凋亡率均明顯升高(P<0.05)。見圖2,表3。

注：A：模型組；B：夏枯草低劑量組；C：夏枯草高劑量組；D：化療組；E：夏枯草聯合化療組圖2 腫瘤組織單細胞懸液激光共聚焦觀察

表3 小鼠腫瘤細胞的凋亡率

3.5 小鼠腫瘤組織中OPGmRNA、RANKmRNA、RANKLmRNA的表達與模型組比較，其余4組RANKmRNA、RANKLmRNA表達量均明顯降低，OPGmRNA表達量及OPG/RANKL均明顯較高(P<0.05)；與夏枯草低劑量組比較，夏枯草高劑量組、化療組、夏枯草聯合化療組RANKmRNA、RANKLmRNA表達量均明顯降低，OPGmRNA表達量及OPG/RANKL均明顯升高(P<0.05)；與夏枯草高劑量組比較，化療組OPGmRNA、RANKmRNA、RANKLmRNA表達量及OPG/RANKL無明顯差異(P>0.05)，夏枯草聯合化療組RANKmRNA、RANKLmRNA表達量均明顯降低，OPGmRNA表達量及OPG/RANKL均明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組腫瘤組織中OPG mRNA、RANK mRNA、RANKL mRNA的表達

3.6 小鼠腫瘤組織中OPG、RANK、RANKL的蛋白表達與模型組比較，其余4組RANK、RANKL蛋白表達量均明顯降低，OPG蛋白表達量及OPG/RANK均明顯升高(P<0.05)；與夏枯草低劑量組比較，夏枯草高劑量組、化療組、夏枯草聯合化療組RANK、RANKL蛋白表達量均明顯降低，OPG蛋白表達量及OPG/RANKL均明顯升高(P<0.05)；與夏枯草高劑量組比較，化療組OPG、RANK、RANKL蛋白表達量及OPG/RANKL無明顯差異(P>0.05)，夏枯草聯合化療組RANK、RANKL蛋白表達量均較低，OPG蛋白相對表達量及OPG/RANKL均明顯升高(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 小鼠腫瘤組織中OPG、RANK、RANKL的蛋白表達

圖3 Western blot圖

4 討論

骨肉瘤在原發性惡性腫瘤中發病率居首位，股骨、脛骨、肱骨及腓骨多見，其中病理分級較高可達88%，且約12%患者可出現早期轉移，早期診斷和治療至關重要[9-11]。骨肉瘤病因目前仍未明確，且發病機制復雜，涉及黏附分子、基因突變、免疫狀況和凋亡等[12]。與其他惡性腫瘤相比，骨肉瘤的典型特征為腫瘤細胞具有成骨性，但其確切的成骨機制仍需進一步探討[13]。常規化療有助于改善患者癥狀，但仍有較高的復發率和轉移率，5年生存率不足70%[14]。研究發現[15]，化療藥物抗藥性、不良反應和肺轉移是影響骨肉瘤轉歸的重要原因，尋找新的靶點治療藥物對改善骨肉瘤預后有重要意義。近年來，中藥在抗腫瘤方面逐漸受到關注，我國中藥資源豐富，尋找抗骨肉瘤中藥有明顯優勢[16-17]。

夏枯草主要藥物部位為其干燥果穗，中醫用于治療目赤膿腫、乳癰腫痛、頭暈目眩等。現代醫學發現，夏枯草對淋巴結核、高血壓、甲狀腺炎等均有較好治療效果[18-20]。夏枯草含有多種活性成分，如三萜類、黃酮類、多糖類、有機酸等[21]，此類化合物均具有顯著抗腫瘤作用。周亞敏等[22]分析夏枯草化學成分發現，從中分離的12種活性化合物中有5種均具有明顯抑制乳腺癌細胞生長的作用。韋云妮等[23]體內實驗發現，夏枯草對非小細胞肺癌荷瘤小鼠瘤體具有顯著抑制作用，其中2.4 g·kg-1劑量的夏枯草效果最佳。本研究中各藥物干預期間一般狀況及精神狀態均有所好轉，腫瘤組織中腫瘤細胞壞死逐漸加重，其中夏枯草聯合化療組一般狀況的改善和腫瘤組織病理學變化最為明顯。與模型組比較，其余4組瘤質量均明顯減輕，抑瘤率和凋亡率均明顯升高，其中夏枯草低劑量組變化稍明顯，高劑量組和化療組其次，聯合化療組變化最為明顯，提示夏枯草對S180骨肉瘤小鼠有顯著抑制作用，且具有增強化療效果的作用。

骨是機體代謝十分活躍的器官，骨吸收和骨合成在整個生命進程不斷的發生。研究發現，OPG/RANK/RANKL在骨代謝中發揮重要調節作用，其相關活性因子間的平衡狀態維持骨正常代謝狀態，一旦失衡可導致骨肉瘤、骨質疏松癥等骨疾病[24-25]。RANK是一種跨膜蛋白，屬于NF-κB受體活化因子，是誘導下游c-Jun氨基酸激酶和NF-κB活化的關鍵因子，當RANK與位于細胞表面的配體RANKL結合后，可激活破骨細胞分化信號通路，參與骨吸收[26-28]。腫瘤壞死因子受體家族成員OPG屬于骨保護蛋白，可競爭性結合RANKL，兩者結合可抑制破骨細胞分化信號傳遞，發揮抑制骨吸收的作用，同時參與調控骨肉瘤細胞凋亡[29-31]。維持OPG-RANK-RANKL系統間的平衡狀態對抑制骨肉瘤細胞增殖及促進凋亡十分重要。本研究應用不同劑量夏枯草及夏枯草聯合化療方法干預骨肉瘤小鼠，結果發現，與模型組比較，其余4組腫瘤組織中RANK、RANKL的基因和蛋白相對表達量均明顯降低，OPG 的基因和蛋白相對表達量及OPG/RANKL均明顯升高，且聯合化療組變化最為明顯，提示夏枯草抑制S180骨肉瘤的作用可能機制為通過下調RANK、RANKL表達，上調OPG表達及OPG/RANKL的值，從而抑制骨肉瘤增殖、促進細胞凋亡。

綜上所述，夏枯草對S180骨肉瘤小鼠有顯著抑制作用，且具有增強化療效果的作用，可能通過下調OPG/RANK/RANKL信號通路中RANK、RANKL表達，上調OPG表達及OPG/RANKL發揮作用，為夏枯草相關抗癌藥物的研發提供理論參考。